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Clonación de un gen codificante en un vector de no expresión


¿Tiene algún sentido clonar un gen de CODIFICACIÓN en un vector sin expresión? hacer esto solo nos dará múltiples copias del gen, mientras que podríamos ejecutar PCR en su lugar (digamos que conocemos la secuencia del gen)


En principio, puede amplificar cualquier gen con PCR y luego clonarlo en un vector de elección. Sin embargo, a menudo no es tan fácil. La mayoría de las cosas se pueden hacer con vectores de expresión, pero a veces es más fácil clonar una secuencia primero y luego subclonarla.

Algunas secuencias son difíciles de amplificar, especialmente cuando son largas o muy largas. Amplificar 2,5kb puede ser complicado, digerir y subclonar una pieza de este tipo podría ser más fácil. Además, los rendimientos de la PCR pueden ser bajos, mientras que se obtiene una gran cantidad de ADN de una minipreparación.

Es posible que desee introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adicionales (uno se puede hacer fácilmente mediante PCR, pero otra vez es complicado), enlazadores o etiquetas adicionales, que no están presentes en todos los vectores de expresión. Entonces es más fácil simplemente hacer un primer paso de clonación en el vector de no expresión y luego tomar el inserto completo en el vector de expresión.


Proceso de clonación de genes

La clonación de genes es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. Con esta técnica podemos aislar y clonar una sola copia de un gen o segmento de ADN en un número indefinido de copias, todas idénticas.

La clonación de genes o clonación molecular es un término general que abarca una serie de protocolos experimentales que conducen a la transferencia de información genética de un organismo a otro.

Pasos de la clonación de genes:

Los siguientes son los pasos de la clonación de genes:

2. Corte de ADN en lugares específicos

3. Amplificación del gen de interés

4. Inserción de ADN recombinante en la célula huésped

5. Selección de recombinantes

Fig: Pasos de la clonación de genes

Aislamiento de material genético (ADN)

Para la clonación molecular, tanto el ADN de origen que contiene la secuencia diana como el vector de clonación deben cortarse consistentemente en fragmentos discretos y reproducibles. Varios métodos, como el cizallamiento mecánico, la digestión por restricción, la síntesis de ADNc, la síntesis química, etc., son útiles en el aislamiento de los fragmentos de ADN.

Corte de ADN en ubicaciones específicas

El vector y el fragmento de ADN diana se pueden digerir por separado con la misma enzima de restricción. A continuación, el vector digerido y el fragmento de ADN diana se incuban juntos en presencia de la enzima ADN ligasa. La incubación da como resultado la unión de dos tipos de ADN mediante enlaces fosfodiéster entre ellos. Por tanto, las cadenas principales de desoxirribosa-fosfato de la molécula de vector y el fragmento de ADN diana se unen covalentemente, formando una molécula de ADN recombinante.

Otra posibilidad en este experimento es volver a unir los extremos pegajosos de la propia molécula de vector, formando una molécula de ADN de vector circular que no tiene una molécula de ADN extraña. El tratamiento del vector digerido con fosfatasa alcalina o el uso de diferentes enzimas de restricción supera la posibilidad anterior.

Amplificación del gen de interés mediante PCR

Este es el proceso de multiplicación selectiva de una región específica de la molécula de ADN. La amplificación se logra mediante un método especial denominado reacción en cadena de la polimerasa. El principio que subyace a la técnica es calentar la molécula de ADN de doble hebra a una temperatura alta para que las dos hebras de ADN se separen en moléculas de ADN de una sola hebra. Tales moléculas de ADN de hebra sencilla requieren cebadores hechos de 10-18 oligonucleótidos para la hibridación de cada hebra de la doble hélice. También requiere de la enzima ADN polimerasa. Es una enzima termoestable también denominada Taq polimerasa. El ciclo de amplificación por PCR implica tres pasos principales: desnaturalización, hibridación y extensión. Al final del proceso, se produce la producción de 2n número de moléculas de ADN durante n número de ciclos completados.

Inserción de ADN recombinante en la célula huésped:

El siguiente paso en un experimento de ADN recombinante requiere la captación del ADN clonado por E. coli. Después de preparar el r-ADN de un vector, entra en un huésped adecuado para la expresión de ADN extraño. El proceso de introducir ADN purificado en una célula bacteriana se denomina transformación.

Para E. coli, uno de los métodos de transformación requiere que las células se traten con alta temperatura y cloruro de calcio. Las cepas de E. coli poseen enzimas de restricción, por lo que degradan el ADN extraño. Para escapar de la degradación, las células que crecen exponencialmente se tratan previamente con cloruro de calcio a baja temperatura. El ADN del vector entra en las células bacterianas.

Selección de recombinantes

Después de la inserción de ADN recombinante en la célula huésped, el siguiente paso es la selección o identificación de los recombinantes. Los métodos utilizados para hacerlo consideran la expresión en la no expresión de ciertos caracteres, especialmente el gen de resistencia a antibióticos (por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina) en el vector plasmídico. El marcador seleccionable normalmente proporciona resistencia contra el sustrato que, cuando se añade al medio de cultivo, inhibe el crecimiento de células o tejidos normales en cultivo, por lo que sólo crecerán los tejidos transformados.

El método más simple de identificación es cultivar células hospedadoras transformadas (con gen de resistencia a ampicilina) en un medio que contenga ampicilina. Esto permitiría que las células que contienen este plásmido transformado crezcan y formen colonias. Existen otros métodos para la detección de recombinantes basados ​​en el hecho de que el fragmento de ADN clonado perturba la secuencia codificante del gen. Esto se denomina inactivación por inserción.

Inactivación por inserción del gen marcador

En este método, la inactivación de un gen marcador del vector mediante la adición del ADN extraño es útil para distinguir los recombinantes de los no recombinantes.

Consideremos un plásmido que contiene genes resistentes a dos antibióticos diferentes, es decir, ampicilina y tetraciclina. El vector pBR322 simple o normal tiene dos genes marcadores de resistencia a antibióticos (es decir, ampicilina y tetraciclina).

La inserción del fragmento de ADN diana en el gen de resistencia a ampicilina da como resultado la inactivación de este gen. Por tanto, las células huésped con tal plásmido recombinante serán sensibles a la ampicilina pero resistentes a la tetraciclina. Estas células huésped morirán cuando se cultiven en un medio que contenga ampicilina, pero crecerán en un medio que contenga tetraciclina. Los vectores autoligados (es decir, no recombinantes) crecerían en un medio que contenga tanto ampicilina como tetraciclina que sea resistente a ellos.

Método de detección visual:

Otro ejemplo similar que implica la inactivación por inserción es el del gen lac z de E. coli. También se denomina selección de blanco azul. Este es el método más rápido de cribado para la selección que se basa en la acción de un producto génico (es decir, una enzima) sobre una sustancia cromogénica (en la hidrólisis se produce un producto de color azul) para distinguir entre los recombinantes y los no recombinantes.

Este método puede explicarse bien con la ayuda del vector pUC. Este vector contiene un gen marcador denominado gen marcador lac z que codifica una enzima denominada beta-galactosidasa. La enzima actúa sobre una sustancia incolora X-gal y la hidroliza en un producto de color azul. La adición de ADN extraño al gen lac z conduce a su inactivación. Por tanto, da como resultado la formación de un vector recombinante.

Los no recombinantes que tienen vector simple formarán colonias azules en el medio nutritivo debido a la actividad del gen lac z funcional, mientras que los recombinantes formarán colonias blancas a medida que la acción del gen lac z se pierda en el vector recombinante.

Fig: Proceso de clonación de genes (selección / cribado de recombinantes)

Morfología de la placa

Es un método importante de cribado de fagos recombinantes. El bacteriófago lambda contiene un gen CI que codifica una proteína CI (una proteína represora). Esta proteína represora de CI es responsable de establecer el ciclo de vida lisogénico en el huésped. E. coli células.


PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Estrategia general de clonación

Un método ampliamente utilizado para generar genes recombinantes implica amplificar el gen de interés por PCR y luego ligar el producto de PCR en el vector plasmídico deseado. Para facilitar este proceso, los cebadores de PCR pueden diseñarse para incorporar sitios de restricción apropiados en los extremos del ADN diana para la posterior digestión y ligación en el vector de elección. La adición de sitios de restricción por PCR durante la amplificación de una secuencia genética permite la inserción de prácticamente cualquier gen diana en cualquier vector [12].

Esta estrategia de clonación se utilizó para crear un recombinante M. sexta GFP-His6-construcción de ADNc de serpin insertada en el vector de expresión pGFPuv (Clontech, Palo Alto, CA) (Fig.1A). Específicamente, un M. sexta-clon de cDNA mutagenizado de serpin1B funcional (A343K) previamente diseñado con His6 La etiqueta en el extremo N de la proteína se utilizó como plantilla en la síntesis de PCR (Fig.1B) [9]. Los cebadores de PCR se diseñaron para agregar un sitio EcoR1 3 '(cadena codificante) y un sitio SacI 5' (cadena codificante) a His6secuencia de -serpin (Fig.2A). Tanto el Su6El producto de PCR -serpin y el vector de expresión pGFPuv fueron digeridos por SacI y EcoRI. El suyo6Luego se insertó el producto de PCR -serpin en el extremo 3 'de la secuencia codificante de GFP utilizando el sitio de clonación múltiple 5' del vector (Fig.1C). La proteína quimérica final lleva GFP en el extremo N-terminal, una His6 etiqueta de afinidad flanqueada por residuos flexibles de glicina en el medio de la construcción, y el ADNc de serpina en el extremo C-terminal (Fig.1D).

Gestión de secuencias

Se utilizó un programa informático a lo largo del curso para documentar y manipular secuencias de ADN, incluida la generación de mapas de restricción y la traducción de secuencias de ADN en secuencias de proteínas. Aunque hay muchos programas de gestión de secuencias disponibles, se utilizó el programa shareware DNA Strider 1.1 (Macintosh) [13]. En muchos casos, las secuencias de plásmido completas pueden descargarse de sitios web comerciales y manipularse con estos programas. El uso de un programa de gestión de secuencias de ADN de este tipo, aunque no es obligatorio, familiariza a los estudiantes con la manipulación de ADN y la gestión de bases de datos. Los programas de gestión de secuencias son extremadamente útiles para desarrollar estrategias de clonación iniciales.

Organización de la serie de laboratorios

Nuestros estudiantes trabajaron individualmente, y cada uno realizó su propio conjunto de reacciones a lo largo del semestre. Sin embargo, participaron en una gran colaboración y apoyo, compartieron materiales, discutieron opciones experimentales, coordinaron el uso del gel de agarosa, etc. Un miembro de la facultad estuvo presente durante todo el período de laboratorio, brindando orientación e intervención adecuada. El período de laboratorio fue un bloque de 3 h una tarde a la semana. En varias ocasiones, se pidió a los estudiantes que realizaran breves preparativos (p.ej. inocular cultivos) en la tarde anterior a nuestra sesión de laboratorio. En la Tabla I se muestra un cronograma propuesto para los ejercicios de laboratorio a lo largo del semestre.

Semana uno

Transformación-

Un M. sexta Serpin cDNA serpin1B (A343K) se clonó previamente en el plásmido de expresión pQME-60, que añadió ADN que codifica una His6 etiqueta de epítopo al extremo N-terminal de la proteína para crear el plásmido serpin1B (A343K) [9]. En principio, cualquier plásmido, aislamiento de ADN genómico o biblioteca de ADNc podría servir como molde para la PCR al comienzo de este experimento. Nuestros estudiantes realizaron transformaciones separadas del plásmido serpin1B (A343K) y pGFPuv en Escherichia coli-células competentes. Durante todas las manipulaciones genéticas, un estable E. coli cepa de clonación que carece de la recA Se utilizó el gen de recombinación, tal como XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) o DH5α (Invitrogen, San Diego, CA). Se obtuvieron de fuentes comerciales células competentes de grado de subclonación que producían ~ 1 x 10 6 transformantes por microgramo de ADN. El protocolo de transformación recomendado por el fabricante de células competente tomó menos de 2 h, y las células resultantes se sembraron en placas que contenían ampicilina. Estas placas se mantuvieron a 37 ° C durante la noche (12-16 h) para permitir un crecimiento suficiente de la colonia bacteriana. Al día siguiente de la transformación, los estudiantes que regresaron al laboratorio sacaron sus placas de la incubadora, anotaron sus resultados y almacenaron sus placas a 4 ° C durante el período intermedio. Se pidió a los estudiantes que calcularan el número de colonias por microgramo de ADN para sus reacciones.

Un control negativo (sin ADN plasmídico) y un control positivo (ADN plasmídico de una fuente comercial, p.ej. pUC18) se incluyeron para la transformación. Nuestros estudiantes utilizaron una solución de agar / Luria-Bertani (LB) templada preparada en autoclave y placas vertidas al comienzo del período de laboratorio. Se añadió al agar líquido una cantidad adecuada de solución madre 1000X de ampicilina (0,1 g de ampicilina / ml de solución de etanol / agua al 50%, almacenada a -20ºC) antes del vertido.

Semana dos

Preparación del plásmido

La tarde anterior al segundo período de laboratorio, los estudiantes comenzaron cultivos pequeños (2 ml) de caldo de ampicilina LB de una sola colonia en sus placas de transformación. El cultivo se incubó a 37 ° C con agitación (225 rpm) durante la noche. Los estudiantes realizaron esta inoculación en ∼15 min. Alternativamente, el profesor o asistente de enseñanza puede iniciar estos cultivos. La incubación de los cultivos no debe exceder las 24 h para garantizar que los plásmidos se produzcan en células sanas.

Durante la sesión de laboratorio, se generó ADN plasmídico adecuado para PCR a partir de este cultivo utilizando un kit de aislamiento de ADN miniprep (disponible en Qiagen a un costo de aproximadamente $ 1 por preparación de plásmido). El procedimiento de minipreparación debe tomar al estudiante promedio ∼1 hy producir 50 μl de plásmido purificado a una concentración de ∼200 ng / μl.

Resúmenes de restricción

Para confirmar que la preparación del plásmido fue exitosa, se realizó una digestión de restricción de diagnóstico. A los estudiantes se les entregó un mapa de plásmidos y se les pidió que diseñaran una digestión de restricción que proporcionara un patrón de fragmentos característico del plásmido correcto. Por ejemplo, la digestión del vector pGFPuv con la enzima SacI o EcoRI debería producir un único fragmento de ADN linealizado de 3,3 kb como se visualiza en un gel de agarosa. Estas enzimas y protocolos de digestión se obtuvieron de fuentes comerciales (p.ej. New England Biolabs, Promega). Generalmente, se digirieron 200 ng de ADN plasmídico purificado en un volumen total de 10 µl. La digestión se puede ampliar fácilmente para digerir grandes cantidades de ADN. El volumen de enzima necesario se calculó usando la actividad de cada preparación de enzima según lo indicado por el fabricante. Una incubación de 30 minutos suele ser suficiente para que una cantidad apropiada de enzima corte específicamente la mayor parte del ADN. Si se desea, se pueden realizar digestiones más complejas utilizando más de una enzima simultáneamente. Si se persigue esta opción, los estudiantes deben seleccionar un tampón de digestión y condiciones de reacción que sean compatibles con todas las enzimas. Los fragmentos de ADN digeridos se almacenaron a -20 ° C hasta la semana siguiente.

Semana tres

Visualización de fragmentos de ADN por electroforesis a través de un gel de agarosa

Los geles E de agarosa (Invitrogen) proporcionan un método rápido y seguro para visualizar los fragmentos de ADN. Los geles no requieren tampón de electroforesis y se ejecutan en menos de 45 min. El gel de agarosa que contiene el bromuro de etidio fluoróforo está sellado entre dos placas de plástico, minimizando así la exposición de los estudiantes a este carcinógeno. Además, no se requiere tampón de carga de ADN, lo que agiliza el proceso de carga. Alternativamente, se puede usar un gel de agarosa estándar que los estudiantes vierten y que se tiñe adecuadamente para visualizar el ADN. Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN se visualizaron usando una fuente de luz ultravioleta. En la Fig. 3 se muestra un ejemplo de un gel E al 1,2% en un transiluminador. Se cargaron aproximadamente 200 ng de ADN en cada carril (equivalente a aproximadamente 1 µl de preparación de ADN). Esta cantidad de ADN dio una banda fácilmente aparente. Es posible que se necesiten mayores cantidades de ADN para ver múltiples bandas o fragmentos de ADN más pequeños (menos de 1.0 kb de longitud). El ADN linealizado se comparó con una escalera de ADN (Sigma o New England Biolabs) para comprobar que se había obtenido un fragmento de la longitud correcta. El ADN plasmídico sin cortar produce un patrón de múltiples bandas de ADN que no se corresponden directamente con la longitud real del plásmido debido al superenrollamiento diferencial del ADN del plásmido circular. Este fue un control útil para determinar si los ADN experimentales estaban completamente cortados.

Semanas tres y cuatro

Diseño de imprimación

Para amplificar la His6-secuencia de ADNc de serpin del plásmido serpin1B (A343K), se diseñaron cebadores de PCR personalizados. Con la ayuda de los instructores, los estudiantes diseñaron y solicitaron cebadores de PCR que introdujeron sitios de restricción en los extremos del ADNc. Los cebadores constaban de dos regiones distintas: los extremos 3 'de los cebadores son complementarios al ADNc y sirvieron como molde para la extensión de la polimerasa. Los extremos 5 'de los cebadores no son complementarios al ADNc de serpina y permiten la introducción de secuencias de ADN específicas al final del producto de PCR (ver Fig.2A).

El cebador "frontal" se diseñó para introducir un nuevo sitio SacI en el producto de amplificación de ADNc de serpina de PCR, que permite la ligación al sitio SacI en el vector pGFPuv (ver Fig.2B). El extremo 3 'del cebador consistía en una región complementaria al extremo 5' de la cadena codificante de His6-cDNA de serpin. los Tmetro de esta interacción del cebador con la plantilla de ADN debe ser ∼60 ° C o mayor. Una regla general es que un par G-C complementario contribuye a la Tmetro alrededor de 4 ° C, mientras que un par A-T contribuye a la Tmetro alrededor de 2 ° C. La región 5 'no complementaria del cebador incluía ADN que codificaba un residuo de glicina aguas arriba de His6 etiqueta para permitir que el dominio GFP se oriente independientemente de His6 etiqueta y la proteína serpina. La adición de la glicina también eliminó el codón de parada endógeno de GFP, lo que permitió la traducción de la secuencia de serpina-GFP de longitud completa. Finalmente, el extremo 5 'del cebador se diseñó para reconstruir los últimos codones del gen GFP, agregar un sitio SacI y una proyección de ADN para permitir la escisión del sitio SacI en His6-producto de PCR de serpin. Las enzimas de restricción a menudo requieren una proyección de ADN para escindir de manera eficiente el sitio de restricción [14].Puede obtener más información sobre los salientes de ADN apropiados para las enzimas de restricción individuales en New England Biolabs (Beverly, MA www.neb.com).

El cebador de PCR "inverso", diseñado para unirse al extremo 5 'de la secuencia de la cadena no codificante del cDNA de serpina, introduce un sitio EcoR1 en el cDNA de serpina (ver Fig.2C). El extremo 3 'de este cebador constaba de una secuencia complementaria al ADNc de serpina. Esta sección complementaria terminaba en el codón de terminación del ADNc de serpina. La parte no complementaria de este cebador (extremo 5 ') añadió un codón de parada adicional para asegurar la terminación de la traducción y contenía el sitio de restricción EcoRI introducido. Finalmente, el extremo 3 'del cebador "trasero" contenía una proyección de ADN multibase más allá del sitio de restricción EcoRI.

Durante la última década, el costo de los cebadores de oligonucleótidos de ADN ha disminuido drásticamente y ahora se pueden solicitar cebadores en línea a compañías como Integrated DNA Technologies o Life Technologies y llegar en menos de 3 días a un costo de aproximadamente

Agradecimientos

Agradecemos a Ishan Dillon, Lacey Verkamp, ​​Monica Silver, Kate Ware, Abigail Gay, Kjersti Knox, Lauren Phillips y Zachary Seymour por su entusiasmo, diligencia y perseverancia durante el transcurso del semestre. La generosa donación de His6Se agradece enormemente el ADNc -serpin de Mike Kanost y Haobo Jiang. Además, agradecemos a Melissa Foster, William Harvey, el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) y los Departamentos de Biología y Química de Earlham College, por la provisión de materiales y equipos utilizados en el curso de la secuencia del laboratorio. J. A. B. quisiera agradecer al HHMI y a los miembros de Earlham College por hacer posible una agradable experiencia docente postdoctoral.

.50 / base de ADN para una preparación de 100 nmol. Por lo tanto, los cebadores se diseñaron y solicitaron en línea en un período de laboratorio. Llegaron antes de la próxima reunión semanal. Los cebadores liofilizados se resuspendieron agitando en vórtex a una concentración de 100 μ M en agua de grado de biología molecular y posteriormente se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 ° C.

Semana 5

Amplificación por PCR de la secuencia diana

La amplificación de la secuencia diana por PCR se realizó utilizando la enzima termofílica. Pfu Turbo (Stratagene), que tiene una mayor fidelidad que muchas otras enzimas de PCR tradicionales (p.ej. Taq polimerasa), reduciendo la frecuencia de errores en el producto de amplificación. Un protocolo detallado para la utilización de PCR Pfu turbo se puede obtener de Stratagene. Para ejecutar la reacción, 100 ng de ADN plasmídico, 100 ng de cada cebador, 5 μl de 10 × Pfu mezcla de tampón, dNTP a una concentración de 500 n M cada uno, agua desionizada a 50 μl y 1 μl de enzima (2,5 U) se mezclaron en un tubo de PCR de pared delgada. Un solo ciclo consistió en una fase de desnaturalización a 95 ° C durante 2 min, una fase de recocido a 67 ° C durante 30 s, y finalmente una fase de extensión a 72 ° C durante 3 min. Esta secuencia se repitió durante 25 ciclos. Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones al diseñar un ciclo de PCR. El tiempo de extensión de la polimerasa debe ser de al menos 2 min / kb de producto de PCR. La temperatura de recocido debe ser 5 ° C más baja que la imprimación más baja Tmetro. Si se utiliza un termociclador sin tapa caliente, se deben colocar 30 μl de aceite mineral encima de cada reacción para evitar la evaporación de la mezcla de reacción. Como el tiempo de ejecución de la PCR puede durar de 3 a 4 h, las reacciones se pueden iniciar durante el período de laboratorio y el termociclador se puede programar para mantener las reacciones a 4 ° C o 10 ° C durante la noche. Los productos de PCR se pueden almacenar durante períodos prolongados a -20 ° C.

Semana 6

Digestión por restricción del producto de PCR y del vector genético.

La presencia de un producto de PCR del tamaño apropiado (1,2 kb) se verificó mediante E-gel (ver Fig. 3). La concentración del producto de la PCR puede variar mucho, por lo que se deben cargar en el gel tanto una cantidad relativamente grande (5 μl) como una pequeña (1 μl) de la PCR. El inserto de PCR deseado debe ser el producto principal visible en el gel.

En preparación para la inserción direccional del fragmento de PCR en el vector pGFPuv, tanto el producto de PCR como el vector se cortaron con SacI y EcoR1. Esta digestión produce extremos monocatenarios "pegajosos" complementarios que facilitan la ligadura del inserto en el vector linealizado. Se pueden realizar digestiones de restricción utilizando dos enzimas diferentes simultáneamente si ambas enzimas están activas en el mismo tampón. Los resultados de las digestiones de restricción del vector y el producto de PCR se analizaron en un gel E para asegurarse de que daban fragmentos de ADN de las longitudes esperadas. Debido a que los sitios de restricción están cerca del final del inserto amplificado, la movilidad de este producto de PCR no cambia apreciablemente con la digestión. De manera similar, el vector digerido se parecía mucho al vector cortado individualmente, ya que solo se cortó del vector una pequeña porción de ADN (menos de 100 bases). Este paso se utilizó para garantizar que no quedara ningún vector sin cortar y que no hubiera digestiones no deseadas en el vector y el producto de PCR. Después de la digestión, el ADN se almacenó a -20 ° C. Los extremos “pegajosos” del ADN monocatenario son especialmente sensibles a la degradación, por lo que se utilizaron reactivos libres de nucleasas durante todas las manipulaciones y se tuvo cuidado para evitar la contaminación de las reacciones. Finalmente, también se produjo de esta manera una preparación de vector digerido solo con EcoR1 para su uso como control positivo en la reacción de ligación posterior.

Semana 7

Purificación en columna de centrifugación de grandes fragmentos de ADN

Los grandes fragmentos de ADN producidos por la digestión de restricción del producto de la PCR en la semana anterior se purificaron mediante un protocolo de columna giratoria para eliminar los contaminantes. Los fragmentos de ADN grandes se recuperaron rápidamente (en menos de 30 min) con alta pureza utilizando columnas de purificación por centrifugación de PCR Qiaquick de acuerdo con el protocolo del proveedor (Qiagen, Valencia, CA). Este paso se utilizó para eliminar enzimas, pequeños fragmentos de ADN (menos de 100 bases) y componentes tampón indeseables. En muchos esquemas de clonación, el uso de una columna de purificación de ADN puede proporcionar una alternativa rápida a las técnicas de purificación en gel.

Tratamiento del vector con fosfatasa intestinal alcalina de ternera

Después de la digestión de restricción, el vector se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP Promega, Madison, WI) para evitar la autoligación en el paso posterior. CIAP elimina los fosfatos 5 'del ADN. Los plásmidos circulares se transforman y replican de manera mucho más eficiente que el ADN linealizado. Si bien la digestión del vector con dos enzimas diferentes debería evitar la ligación del vector solo, el uso de CIAP evita la ligación de cualquier vector cortado individualmente, reduciendo el número de falsos positivos en las reacciones de ligación posteriores. Se usó un exceso de CIAP en una reacción de 30 minutos para tratar suficiente vector linealizado. A continuación, el vector se purificó inmediatamente usando una columna de rotación de PCR (Qiagen) para eliminar la enzima CIAP. El vector purificado se almacenó a -20 ° C hasta la semana siguiente. Se reservó una alícuota de vector digerido no tratado con CIAP para su uso como reacción de control en la etapa de ligación. El vector EcoRI cortado individualmente también se trató con CIAP como control.

Semana 8

Ligadura y transformación de reacciones

El inserto y el vector de PCR digeridos purificados (tratados con CIAP) se ligaron para formar el nuevo plásmido recombinante pMAJILK que contiene la GFPuv-His6-secuencia de pinchos (ver Fig. 1). Utilizando un kit de ligadura rápida introducido recientemente (New England Biolabs), el tiempo de incubación de la ligadura fue de 5 minutos a temperatura ambiente. Esto permitió que la reacción de ligadura y la transformación se completaran en un solo período de laboratorio. En la reacción se usó una relación molar de ∼2: 1 inserto a vector. Deben utilizarse al menos 200 ng de vector linealizado. Inicialmente, solo la mitad del producto de ligación se usó en la transformación en caso de que la transformación no tuviera éxito. El inserto y el vector no utilizados se almacenaron a -80 ° C para futuros intentos de ligación.

Las transformaciones de los productos de ligación se realizaron utilizando preparaciones de células competentes de alta eficacia con eficiencias de transformación de al menos 106 transformantes por microgramo de ADN plasmídico viable. Las reacciones de transformación se sembraron en placas de agar LB que contenían el antibiótico apropiado. Se deben utilizar varias placas de agar para colocar en placa todo el volumen de reacción de ligadura. Para comprobar la eficacia de la ligadura, se trató con ligasa una muestra de vector de expresión cortado solo con EcoR1 (sin CIAP) y se comparó con una muestra sin tratar. Para comprobar la reacción de CIAP, también se incluyó una muestra del vector de corte EcoRI tratado con CIAP. Como control negativo, también se transformó una muestra que contenía el vector tratado con CIAP y el inserto pero no expuesto a ligasa. Finalmente, se emplearon reacciones de transformación de control positivo y negativo como se describió anteriormente para verificar la efectividad del procedimiento de transformación.

Semana 9

Análisis de restricción de los productos genéticos

Después de la siembra en placa de la reacción de transformación, se observó típicamente un pequeño número de colonias (menos de 50). Se cultivó un número limitado de colonias (~ 5) en cultivos separados de 2 ml que contenían antibiótico y se realizó un aislamiento de ADN plasmídico de cada cultivo. Como se describió anteriormente, estos cultivos se inocularon el día anterior a la reunión de laboratorio. Se realizó una digestión de restricción de diagnóstico usando EcoRI y SacI para analizar si los plásmidos aislados contenían el inserto recombinante. Las digestiones se almacenaron a -20 ° C hasta la semana siguiente.

Semana 10

Gel de agarosa de la digestión de restricción diagnóstica—

Las digestiones de restricción de diagnóstico se visualizaron en un E-gel (ver Fig. 3). La digestión de plásmidos sin el inserto recombinante produjo solo vector linealizado. La digestión de los plásmidos recombinantes deseados a partir de colonias recombinantes resultó en la observación de un inserto liberado (1,2 kb) que contiene His6gen -serpin así como el vector linealizado. Utilizando este procedimiento, nuestros estudiantes observaron consistentemente insertos en ~ 50% de las preparaciones de plásmidos. Si bien la observación de un inserto en estos digestiones de restricción de diagnóstico indica claramente la finalización satisfactoria del proceso de subclonación, los plásmidos con insertos deben investigarse más mediante secuenciación.

Diseño y pedido de cebadores de secuenciación

Los cebadores para la secuenciación tenían entre 22 y 25 bases de longitud y eran completamente complementarios al gen de interés. La selección del sitio en el gen para el diseño de cebadores se basó en varios factores. En primer lugar, el espaciado de los cebadores fue de aproximadamente cada 400 bases para permitir una secuenciación completa y precisa de toda la secuencia de interés. En segundo lugar, la temperatura de fusión fue de 55 a 60 ° C, con un contenido de GC de 45 a 60% de acuerdo con los requisitos de la instalación de secuenciación. En tercer lugar, se verificaron los cebadores en busca de autocebantes y bucles utilizando software de Integrated DNA Technologies (www.IDTDNA.com). Finalmente, los cebadores se localizaron ∼50 bases corriente arriba (3 ') del comienzo de la secuencia a leer. Para algunos plásmidos de uso común, se encuentran disponibles cebadores de secuenciación preparados comercialmente.

Semana 11

Secuenciación de los plásmidos que contienen el inserto de ADN.

Una prueba crucial de un experimento de clonación exitoso es la secuenciación del inserto del gen junto con las secciones flanqueantes del vector. Aunque los secuenciadores automáticos son generalmente demasiado costosos para las universidades pequeñas de artes liberales, las secuencias de ADN se pueden obtener fácil y económicamente a través de proveedores externos. Estos proveedores normalmente requieren que se les envíe un plásmido purificado y un cebador de secuenciación. Este proceso normalmente requiere menos de 10-12 μl de muestra de plásmido purificada en columna de centrifugación con una concentración de 150-200 ng / μl. Una reacción de secuenciación típica produce alrededor de 700 bases de secuencias legibles y cuesta entre 9 y 13 dólares por reacción, según la empresa. Usamos Genegateway (www.genegateway.com), que costó $ 9 por reacción y tuvo un tiempo de respuesta muy corto (menos de 3 días).

Semana 12

Interpretación de los resultados de la secuenciación de plásmidos

La secuencia se transmitió desde Genegateway por correo electrónico en un archivo comprimido que, cuando se expandió, proporcionó tanto el cromatograma de secuencia original como un archivo de secuencia. En la Fig. 4 se muestra un ejemplo de cromatograma. En este método de secuenciación automática, cada base terminal se marca con un tinte fluorescente diferente [15]. A medida que los diferentes fragmentos de ADN migran a través de una matriz y pasan por un detector, las intensidades fluorescentes relativas observadas se utilizan para determinar la identidad de la base de ADN terminal. La secuencia automatizada leída se puede alinear con la secuencia de vector / gen esperada usando un programa como ClustalW. Hay muchos sitios de ClustalW en la web, como pir.georgetown.edu/pirwww/search/multaln.html. Las discrepancias entre las secuencias de ADN esperadas y obtenidas deben investigarse más a fondo. Debido a que puede haber errores en la lectura automática de bases, se recomienda encarecidamente que los estudiantes editen el cromatograma donde ocurren discrepancias para asegurarse de que la secuencia leída correctamente se corresponda con el cromatograma. Se debe prestar especial atención a las regiones de los cebadores porque un error en la síntesis del cebador puede resultar en mutaciones inesperadas, y lo hizo en uno de nuestros clones seleccionados.


Términos clave

  • reacción en cadena de la polimerasa: Una técnica en biología molecular para crear múltiples copias de ADN a partir de una muestra utilizada en huellas genéticas, etc.
  • clonación molecular: conjunto de métodos experimentales en biología molecular que se utilizan para ensamblar moléculas de ADN recombinante y dirigir su replicación dentro de los organismos hospedadores.
  • enzima restrictiva: Endonucleasa que cataliza la escisión bicatenaria del ADN que contiene una secuencia específica.

La tecnología de ADN recombinante, también conocida como clonación molecular, es similar a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que permite la replicación de una secuencia de ADN específica. La diferencia fundamental entre los dos métodos es que la clonación molecular implica la replicación del ADN en un microorganismo vivo, mientras que la PCR replica el ADN en un microorganismo vivo. in vitro solución, libre de células vivas.

En los experimentos de clonación molecular estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos:

  1. Elección del organismo huésped y del vector de clonación
  2. Preparación del vector de ADN
  3. Preparación de ADN para clonar
  4. Creación de ADN recombinante
  5. Introducción de ADN recombinante en el organismo huésped
  6. Selección de organismos que contienen ADN recombinante
  7. Detección de clones con insertos de ADN deseados y propiedades biológicas

Aunque se utiliza una gran cantidad de organismos hospedadores y vectores de clonación molecular, la gran mayoría de los experimentos de clonación molecular comienzan con una cepa de laboratorio de la bacteria. E. coli (Escherichia coli) y un vector de clonación de plásmidos. E. coli y los vectores plasmídicos son de uso común porque son técnicamente sofisticados, versátiles, ampliamente disponibles y ofrecen un crecimiento rápido de organismos recombinantes con un equipo mínimo. El vector de clonación se trata con una endonucleasa de restricción para escindir el ADN en el sitio donde se insertará el ADN extraño. La enzima de restricción se elige para generar una configuración en el sitio de escisión que sea compatible con la de los extremos del ADN extraño.

Normalmente, esto se hace escindiendo el ADN del vector y el ADN extraño con la misma enzima de restricción, por ejemplo EcoRI. La mayoría de los vectores modernos contienen una variedad de sitios de escisión convenientes que son únicos dentro de la molécula del vector (de modo que el vector solo se puede escindir en un solo sitio) y está ubicado dentro de un gen (frecuentemente beta-galactosidasa) cuya inactivación puede usarse para distinguir recombinante de organismos no recombinantes en un paso posterior del proceso. Para mejorar la proporción de organismos recombinantes y no recombinantes, el vector escindido puede tratarse con una enzima (fosfatasa alcalina) que desfosforila los extremos del vector. Las moléculas de vector con extremos desfosforilados no pueden replicarse y la replicación solo se puede restaurar si se integra ADN extraño en el sitio de escisión.

Para la clonación de ADN genómico, el ADN a clonar se extrae del organismo de interés. Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizan a menudo para la amplificación de secuencias específicas de ADN o ARN (RT-PCR) antes de la clonación molecular. A continuación, el ADN purificado se trata con una enzima de restricción para generar fragmentos con extremos capaces de unirse a los del vector. Si es necesario, se pueden añadir segmentos cortos de ADN bicatenario (enlazadores) que contienen los sitios de restricción deseados para crear estructuras terminales que sean compatibles con el vector. La creación de ADN recombinante es, en muchos sentidos, el paso más simple del proceso de clonación molecular. El ADN preparado a partir del vector y la fuente extraña simplemente se mezclan en concentraciones apropiadas y se exponen a una enzima (ADN ligasa) que une covalentemente los extremos. Esta reacción de unión a menudo se denomina ligadura. La mezcla de ADN resultante que contiene extremos unidos aleatoriamente está lista para su introducción en el organismo huésped. La mezcla de ADN, previamente manipulada in vitro, se devuelve a una célula viva, denominada organismo huésped. Los métodos utilizados para introducir ADN en las células son variados, y el nombre que se aplique a este paso en el proceso de clonación molecular dependerá a menudo del método experimental que se elija (por ejemplo, transformación, transducción, transfección, electroporación).

Cuando los microorganismos son capaces de captar y replicar el ADN de su entorno local, el proceso se denomina transformación, y se dice que las células que se encuentran en un estado fisiológico tal que pueden absorber el ADN son competentes. Cuando se utilizan células bacterianas como organismos hospedadores, el marcador seleccionable suele ser un gen que confiere resistencia a un antibiótico que de otro modo mataría las células, típicamente ampicilina. Las células que albergan el vector sobrevivirán cuando se expongan al antibiótico, mientras que aquellas que no hayan asimilado las secuencias del vector morirán. Los vectores de clonación bacteriana modernos (por ejemplo, pUC19) utilizan el sistema de selección azul-blanco para distinguir colonias (clones) de células transgénicas de aquellas que contienen el vector parental.

En estos vectores, el ADN extraño se inserta en una secuencia que codifica una parte esencial de la beta-galactosidasa, una enzima cuya actividad da como resultado la formación de una colonia de color azul en el medio de cultivo que se utiliza para este trabajo.La inserción del ADN extraño en la secuencia de codificación de la beta-galactosidasa inhabilita la función de la enzima, de modo que las colonias que contienen plásmidos recombinantes permanecen incoloras (blancas). Por tanto, los clones recombinantes se identifican fácilmente.

Figura: Pantalla azul blanca: La pantalla azul-blanca es una técnica de cribado que permite la detección de ligaciones exitosas en la clonación de genes basada en vectores. El ADN de interés se liga a un vector. Luego, el vector se transforma en una célula competente (bacteria). Las células competentes se cultivan en presencia de X-gal. Si la ligadura fue exitosa, la colonia bacteriana será blanca; de lo contrario, la colonia será azul. Esta técnica permite la detección rápida y sencilla de una ligadura exitosa.


Un vector de clonación es una pequeña molécula de ADN que transporta un fragmento de ADN extraño a la célula huésped, mientras que el vector de expresión es un tipo de vector que facilita la introducción, expresión de genes y producción de proteínas. Entonces, esta es la diferencia clave entre el vector de clonación y el vector de expresión. Además, otra diferencia significativa entre el vector de clonación y el vector de expresión es que un vector de clonación introduce un fragmento de ADN extraño en un huésped, mientras que los vectores de expresión expresan el gen introducido produciendo la proteína relevante.

Además, el vector de clonación consta de un origen de replicación, sitios de restricción y un marcador seleccionable. Mientras que, el vector de expresión contiene potenciadores, región promotora, codón de terminación, secuencia de inicio de la transcripción, un origen de replicación, sitios de restricción y un marcador seleccionable. Por lo tanto, esta también es una diferencia entre el vector de clonación y el vector de expresión. Además, los plásmidos, bacteriófagos, cromosomas artificiales bacterianos, cósmidos, cromosomas artificiales de mamíferos, cromosomas artificiales de levadura, etc., son ejemplos de vectores de clonación. Mientras tanto, los vectores de expresión son en su mayoría plásmidos.


Clonación de un gen codificante en un vector de no expresión - Biología

Las piezas de BioBrick son secuencias de ADN que siguen un estándar específico de ensamblaje de enzimas de restricción. Existen estándares específicos para compilar y mantener un registro de estas piezas de BioBrick, así como métodos de ensamblaje utilizados para construir esas piezas en dispositivos y sistemas para producir una proteína deseada en microorganismos modelo. Los BioBricks pueden pensarse como bloques de construcción o legos que se pueden unir de diferentes maneras para ensamblar circuitos biológicos sintéticos más grandes que juntos tienen una función única. Estos circuitos biológicos se pueden incorporar luego en células vivas, como E. coli, para construir nuevos sistemas biológicos y realizar funciones definidas. Los ejemplos de partes de BioBrick incluyen secuencias codificantes, promotores, sitios de unión ribosómica y terminadores.
El estándar BioBricks es un estándar empírico y universal para definir las secuencias de ácidos nucleicos de las partes y describe cómo se pueden combinar con las secuencias de otras partes dentro de los vectores de clonación. Esto permite la estandarización de las piezas de BioBrick. Los diferentes estándares utilizados para definir las piezas de BioBrick se describen en la página "Estándares de ensamblaje para BioBricks". El ensamblaje de BioBrick se refiere a los métodos y procedimientos utilizados para compilar las secuencias de las piezas, que se describe con más profundidad en la página "Técnicas de ensamblaje para BioBricks".
Los bioladrillos son increíblemente útiles para muchas industrias diferentes que utilizan estrategias de clonación para producir productos como medicamentos terapéuticos o enzimas utilizadas en los alimentos. Estas industrias incluyen productos farmacéuticos, procesamiento de alimentos, biocombustibles y muchos otros. Muchas de estas industrias están aprovechando las herramientas de biología sintética, como BioBricks, para diseñar organismos que produzcan muchos de sus productos. La biología sintética se puede definir como A) el ensamblaje de nuevas partes, dispositivos y sistemas biológicos o B) la reconfiguración de sistemas biológicos naturales existentes para propósitos útiles. Los BioBricks facilitan el diseño y el ensamblaje de las vías biológicas necesarias para que los organismos modificados realicen nuevas tareas.

Este video proporciona una introducción a la biología sintética.

Se puede encontrar una base de datos de piezas de BioBrick en el registro de piezas biológicas estándar que facilita a los investigadores compartir piezas y colaborar. Una parte biológica se define como una secuencia específica de ácidos nucleicos que codifica una característica biológica definible. El registro contiene más de 20.000 piezas de BioBrick que se han catalogado y categorizado en función de su función biológica. Cada entrada del catálogo describe la función, el rendimiento y el diseño de la pieza. Cada pieza de BioBrick también viene con un código de identificación único. El registro fue creado por investigadores del MIT, Harvard y UCSF. Cada año los participantes en la competencia iGEM y los laboratorios académicos contribuyen al registro, por lo que el registro está creciendo considerablemente con el tiempo.

¡El registro de partes biológicas estándar se puede encontrar aquí!

Una innovación clave del estándar de ensamblaje de BioBrick es que un ingeniero puede unir dos piezas de BioBrick cualesquiera y la forma combinada posterior también es una pieza de BioBrick que se puede unir con cualquier otra pieza de BioBrick. La estandarización de BioBricks permite la producción distribuida de una colección de piezas biológicas. Los ingenieros de diferentes partes del mundo pueden diseñar piezas que se ajusten al conjunto de estandarización y estas dos piezas podrán unirse ya que siguen el mismo estándar. Además, los ingenieros llevan a cabo exactamente el mismo proceso cuando combinan dos piezas de BioBrick, por lo que el proceso de ensamblaje está abierto a la optimización y la automatización en contraste con los enfoques de clonación molecular más tradicionales para combinar secuencias genéticas. El registro no solo puede ser utilizado por cualquier investigador o ingeniero del planeta para identificar qué partes biológicas serían más propicias para facilitar un determinado proceso de fabricación, sino que estos científicos también pueden contribuir con sus propios descubrimientos al registro después de la validación por parte de quienes mantienen el registro. base de datos. Esto sirve para afirmar que BioBricks es una herramienta muy versátil y diversa en un estado continuo de volverse más integral, lo que la convierte en uno de los recursos más útiles disponibles para los biólogos sintéticos en todo el mundo.


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7 pasos principales involucrados en la clonación de genes

Los siguientes puntos destacan los siete pasos principales involucrados en la clonación de genes. Algunos de los pasos son: 1. Aislamiento de fragmentos de ADN (gen de interés) que se van a clonar 2. Inserción de ADN aislado en un vector adecuado para formar el ADN recombinante y tímido 3. Introducción del ADN recombinante en un organismo adecuado conocido como huésped y otros pasos también.

Paso de clonación genética n. ° 1.

Aislamiento de fragmentos de ADN (gen de Inter y más tímido) a clonar:

Antes de llevar a cabo la operación de clon y shying de genes, necesitamos dos cosas básicas en su estado purificado: el gen de nuestro interés (GI) y el vector. Un GI es un fragmento de gen cuyo prod & shyuct (una proteína, enzima u hormona) nos interesa. Por ejemplo, gen que codifica la hormona insulina.

De manera similar, el vector es una molécula portadora que puede llevar nuestro GI a un huésped, replicarse allí junto con el GI haciendo sus múltiples copias. En este estado, el GI también se puede expresar en la célula huésped produciendo el producto del gen que necesitamos.

Paso 2 de la clonación genética.

Inserción de ADN aislado en un vector adecuado para formar el ADN recombinante:

Una vez que los ingredientes estén listos podemos iniciar la operación. Nuestro siguiente paso será cortar tanto los vectores como el GI utilizando un tipo especial de enzima, llamada endonucleasa de restricción. Una endonucleasa de restricción es una enzima que corta el ADN monocatenario o bicatenario en secuencias de nucleótidos de reconocimiento específicas conocidas como sitios de restricción hacia la región interna (de ahí la endonucleasa).

También se consideran tijeras moleculares, ya que cortan las hebras de ADN. Después de este paso de corte pasamos a pegar. Aquí se toma el GI y se pega en el vector de corte. Este procedimiento también necesita una enzima, llamada ADN ligasa. También se consideran pegamento molecular.

El resultado y la molécula de ADN tímida es un híbrido de dos moléculas de ADN: nuestro GI y el vector. En la terminología de la genética, esta mezcla de diferentes cadenas de ADN se llama recombinación (que, naturalmente, tiene lugar en la profase 1 de la meiosis 1). Por lo tanto, esta nueva molécula de ADN híbrido también se denomina molécula de ADN recombinante y esta tecnología se denomina tecnología de ADN recombinante (RDT).

Paso 3 de la clonación de genes.

Introducción del ADN recombinante en un organismo adecuado conocido como huésped:

Cuando nuestra molécula de ADN recombinante esté lista, debemos introducirla en un sistema vivo conocido como huésped.

Esto se hace por una o ambas de las siguientes razones:

(a) Para replicar la molécula y la molécula de ADN recombinante con el fin de obtener las múltiples copias de nuestro IG.

(b) Para permitir que nuestro GI se exprese y produzca la proteína que necesitamos.

La introducción del ADN recombinante en la célula huésped se realiza de diversas formas y depende estrictamente del tamaño de la molécula de ADN y de la naturaleza del IG. Algunos de los métodos seguidos para llevar a cabo este paso incluyen electroporación, microinyección, lipofección, etc.

Cuando llevamos a cabo este proceso, algunas de las células huésped absorberán el ADN recombinante y otras no. Las células hospedadoras que han absorbido el ADN recombinante se denominan células transformadas y el proceso pro y tímido se denomina transformación.

Paso 4 de la clonación de genes.

Selección de las células hospedadoras transformadas e identificación del clon que contiene el gen de interés:

El proceso de transformación genera una población mixta de células huésped transformadas y no transformadas. Como solo nos interesan las células hospedadoras transformadas, es necesario filtrarlas. Esto es exactamente lo que se hace en el proceso de selección. Hay muchas estrategias de selección existentes, algunas de las cuales incluyen la ayuda de genes informadores, la técnica de hibridación de colonias, etc.

Paso 5 de la clonación de genes.

Multiplicación / expresión del gen introducido en el anfitrión:

Una vez que hemos purificado nuestras células huésped transformadas mediante el proceso de selección, ahora es nuestro trabajo proporcionarles los parámetros óptimos para crecer y multiplicarse. En este paso, las células hospedadoras transformadas se introducen en medios de cultivo frescos que les proporcionan una rica nutrición seguida de una incubación en el horno a la temperatura y temperatura adecuadas.

En esta etapa, las células huésped se dividen y se vuelven a dividir junto con la replicación del ADN recombinante que llevan. Ahora, en este punto, tenemos dos opciones.

Cuando el objetivo del proceso de clon & shying es generar una biblioteca de genes, nuestro objetivo será obtener numerosas copias de GI. Entonces, con este plan en mente, simplemente buscaremos la replicación del ADN recombinante y no más allá de eso.

Si el objetivo del experimento de clonación es obtener el producto de GI, entonces daremos un paso adelante en el que proporcionaremos condiciones favorables a las células huésped en las que el GI sentado en el vector puede expresar nuestro producto de interés (PI). .

Paso de clonación genética n. ° 6.

Aislamiento de las copias de genes multiplicados / proteína expresada por el gen intro y tímido:

En este paso aislamos nuestro GI multiplicado que está presente adjunto con el vector o el pro & shytein codificado por él. Esto puede compararse con razón con el proceso de recolección donde recolectamos la cosecha del campo. Hay muchos procesos de aislamiento, cuya selección varía de un caso a otro.

Paso # 7 de la clonación de genes.

Purificación de la proteína / copia genética aislada:

Después de la recolección de la copia del gen aislado o la proteína, ahora es nuestro trabajo purificarlos.


Factores críticos que afectan el éxito de la clonación, expresión y producción masiva de enzimas recombinantes E. coli

E. coli es el hospedador más utilizado para la producción de enzimas y otras proteínas mediante tecnología de ADN recombinante. E. coli es preferible por su relativa simplicidad, bajo costo y rápido cultivo de alta densidad, genética bien conocida y gran número de herramientas moleculares compatibles disponibles. A pesar de todas estas ventajas, la expresión y producción de enzimas recombinantes no siempre tienen éxito y, a menudo, dan como resultado proteínas insolubles y no funcionales. Hay muchos factores que afectan el éxito de la clonación, expresión y producción masiva de enzimas por recombinación. E. coli. En este artículo, estos factores críticos y enfoques para superar estos obstáculos se resumen enfocándose en la expresión controlada de la proteína / enzima diana en una forma no modificada a nivel industrial.

1. Introducción

En los últimos años, la tecnología del ADN recombinante ha permitido a los científicos producir una gran cantidad de proteínas diversas, en microorganismos, que antes no estaban disponibles, eran relativamente caras o difíciles de obtener en cantidad [1]. Si bien la expresión de genes extraños se ha informado en una variedad de microorganismos y líneas celulares, la mayor parte de este trabajo utiliza E. coli para la clonación y expresión de genes extraños [2]. La producción de enzimas implica la clonación del gen apropiado en un vector de expresión bajo el control de un promotor inducible [3].

2. Producción de enzimas en E. coli

La expresión de proteínas recombinantes en células en las que no ocurren naturalmente se denomina producción de proteínas heterólogas. Los sistemas de expresión bacteriana se utilizan comúnmente para la producción de productos génicos heterólogos de origen eucariota y procariota [4]. La expresión de proteínas heterólogas en E. coli, que es el sistema bacteriano, se utiliza de forma más generalizada y rutinaria. Varias proteínas terapéuticamente importantes se producen ahora como heterólogas en E. coli. La primera proteína heteróloga que se empleó clínicamente fue la insulina humana producida en E. coli, aprobado por primera vez en 1982, en el Reino Unido, Alemania Occidental, Países Bajos y EE. UU. [5] (Tabla 1).

3. Consideraciones generales de selección E. coli como anfitrión de expresión de proteínas heterogéneas

E. coli se utiliza ampliamente como hospedador para la expresión de proteínas heterogéneas por las siguientes ventajas: (1) facilidad de crecimiento y manipulación utilizando equipos de laboratorio simples (2) disponibilidad de docenas de vectores y cepas hospedadoras que se han desarrollado para maximizar la expresión (3) una riqueza de conocimiento sobre la genética y fisiología de E. coli (4) la expresión a menudo se puede lograr con bastante rapidez comenzando con un clon de ADNc eucariota, expresa la proteína en E. coli, y purificar en cantidades de miligramos en menos de 2 semanas (5) una tecnología de fermentación adecuada bien establecida (6) puede generar suministros potencialmente ilimitados de proteína recombinante (7) económicamente atractiva [6].

4. Limitaciones de uso E. coli como anfitrión de expresión de proteínas heterogéneas

Son (1) incapacidad de E. coli como procariota para llevar a cabo una modificación postraduccional que es típica de eucariotas (2) capacidad limitada para llevar a cabo una formación extensa de enlaces disulfuro (3) algunas proteínas se producen en forma insoluble, como consecuencia del plegamiento incorrecto, agregación y acumulación intracelular de proteínas como cuerpos de inclusión (4) a veces, es posible que no se observe una expresión suficiente debido a la degradación de la proteína o la traducción insuficiente (el ARNm puede permanecer en la estructura secundaria y la traducción se ve obstaculizada) (5) la secuencia de codones para un aminoácido específico en eucariotas es diferente de procariotas como E. coli. Este fenómeno se conoce como "sesgo de codón" que dificulta enormemente la síntesis de proteínas y la expresión génica en E. coli [6].

5. Factores que afectan la expresión de enzimas en E. coli

La expresión de genes de enzimas en E. coli está influenciado por una variedad de factores. Estos se analizan a continuación.

5.1. Características estructurales únicas y sutiles de la secuencia genética

Las secuencias de ADN únicas están involucradas en diferentes etapas de expresión de enzimas recombinantes como la transcripción y traducción.

(a) Secuencias de ADN implicadas en la transcripción. En la transcripción de genes intervienen tres secuencias de ADN diferentes y una proteína multicomponente. (1) El promotor: los promotores normalmente constan de tres regiones llamadas caja -35 y -10 y la región espaciadora que separa ambas cajas. La alineación de muchos promotores permite la deducción de la denominada secuencia consenso. Esta secuencia representa la secuencia promotora óptima con una región espaciadora de 17 nucleótidos. Cabe mencionar que no existe un solo promotor presente en el E. coli cromosoma idéntico a la secuencia consenso. En la mayoría de los casos, hay una o dos desviaciones tanto en el cuadro −35 como en el −10 [4]. (2) El terminador transcripcional: se requiere un terminador de la transcripción para permitir la terminación de la transcripción. Se han descrito dos clases de terminadores, terminadores independientes y dependientes de factores [7]. (3) La secuencia reguladora: los genes se expresan constitutivamente o se regulan. Se han descrito dos clases diferentes de reguladores, represores transcripcionales y activadores transcripcionales. Los represores se unen a operadores ubicados dentro de la región promotora o inmediatamente aguas abajo de ella y, en la mayoría de los casos, evitan la unión del promotor de la ARN polimerasa o actúan como un obstáculo. Para aliviar la represión, el represor debe disociarse de su operador. En algunos casos, un inductor será sintetizado por la célula o tomado del ambiente que se une al represor causando la disociación de su operador [3]. (4) La ARN polimerasa: la ARN polimerasa consta de cinco componentes diferentes denominados α, β, β′, ω, y σ. Tiempo α2ββω constituyen la enzima central, la adición de σ el que confiere especificidad al promotor constituye la holoenzima. los σ factor es responsable del reconocimiento del promotor, y se deduce que cada σ factor reconoce un promotor diferente [8]. E. coli códigos para seis factores alternativos donde σ Se necesita 32 después de un cambio repentino de temperatura y σ S reemplaza la limpieza σ factor σ 70 durante la fase estacionaria. Hasta ahora, solo σ 70 se utiliza en la producción de proteínas recombinantes como las enzimas [3].

(b) Secuencias de ADN involucradas en la traducción. Quedó claro que la amplia gama de eficiencias en la traducción de diferentes ARNm se debe predominantemente a la estructura en el extremo 5 'de cada especie de ARNm. La región de inicio de la traducción comprende cuatro secuencias diferentes: (1) la secuencia de Shine-Dalgarno, (2) el codón de inicio, (3) la región espaciadora entre la secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio, se ha determinado que el espaciado óptimo es 4 a 8 nucleótidos y (4) potenciadores de la traducción [3].

La estructura secundaria en la región de inicio de la traducción del ARNm juega un papel importante en la eficiencia de la expresión génica. Se ha demostrado que la oclusión de la secuencia de Shine-Dalgarno y / o el codón de inicio por una estructura de tallo-bucle previene la accesibilidad a la subunidad ribosómica 30S e inhibe la traducción [9]. La mutación de nucleótidos específicos hacia arriba o hacia abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno suprimió la formación de estructuras secundarias de ARNm y mejoró la eficiencia de traducción [10, 11].

5.2. La "fuerza" del promotor transcripcional

Para una mayor expresión, el gen de las enzimas debe colocarse bajo el control de un promotor fuerte. Se han desarrollado muchos vectores plasmídicos y bacteriófagos en los que el gen clonado está situado inmediatamente aguas abajo de un fuerte promotor transcripcional [2]. El uso de estos vectores requiere que el promotor no sea constitutivo (es decir, siempre encendido) sino que, más bien, esté encendido en una etapa específica del crecimiento del transformado. E. coli células. Esto a menudo se logra mediante la adición de un metabolito específico o mediante un cambio en la temperatura del medio de crecimiento [12]. La regulación de la actividad del promotor asegura que la expresión de un gen extraño no interfiera con las funciones génicas celulares normales y no sea perjudicial para la célula. La falta de regulación de la expresión de promotores fuertes a menudo da como resultado la pérdida del plásmido que lleva el promotor fuerte o la expresión constitutiva del promotor fuerte que puede ser letal para la célula [13].

Los promotores fuertes más utilizados son los E. coli operones trp y lac, el promotor tae (un in vitro constructo que incluye elementos de los promotores trp y lac), y el promotor hacia la izquierda, o pL, del bacteriófago lambda [4].

5.3. La estabilidad del vector en E. coli Células

Una vez que se ha clonado un gen extraño en un vector de expresión, el vector se introduce en E. coli células que se convierten en una fuente de proteína extraña. Sin embargo, los plásmidos no siempre son estables, especialmente en células cultivadas durante muchas generaciones en cultivos a gran escala [14], por lo que cuando se amplía un proceso es importante abordar la estabilidad del vector. Dado que una cepa libre de plásmidos tiene una tasa de crecimiento específica más rápida que una cepa que contiene plásmidos, como resultado de la energía metabólica que se gasta para el mantenimiento del plásmido, la cepa libre de plásmidos eventualmente superará a la cepa que contiene plásmidos [15] .

5.3.1. Razones de inestabilidad

(1) La estabilidad del plásmido está influenciada por el vector y los genotipos del hospedador; el mismo plásmido en diferentes hospedadores exhibe diferentes grados de estabilidad y viceversa [16]. (2) Se ha observado que el origen y el tamaño del ADN extraño afectan la estabilidad del plásmido [16]. (3) La pérdida de plásmido ocurre primero a nivel de la célula individual como resultado de una segregación defectuosa en la división celular, y luego a nivel de población [15]. (4) La inestabilidad se debe al aumento de la energía metabólica necesaria para el mantenimiento y la función del plásmido [17]. (5) La estabilidad del plásmido también es una función de los parámetros fisiológicos que afectan la tasa de crecimiento de la célula huésped, que incluyen el pH, la temperatura, la tasa de aireación, los componentes del medio y la acumulación de proteínas heterólogas [16].

5.3.2. Soluciones al problema de la inestabilidad

(1) El método más común para asegurar que no se pierda un plásmido recombinante durante el crecimiento del microorganismo es la inclusión de antibióticos que se seleccionan por la presencia de plásmidos que portan los genes de resistencia a antibióticos apropiados. Sin embargo, la ampliación de este enfoque puede no ser económicamente viable debido al costo de los antibióticos añadidos que se colocan en la celda [14]. (2) Una estrategia análoga implica el uso de vectores plásmidos de replicación descontrolada donde el número de copias del plásmido es relativamente bajo a temperaturas más bajas y aumenta cuando se eleva la temperatura. El menor número de copias de plásmido durante gran parte del ciclo de crecimiento celular reduce la carga metabólica en la célula y asegura la estabilidad del plásmido. Al mismo tiempo, el mayor número de copias de plásmido para una parte del ciclo de crecimiento da como resultado altos niveles de expresión del gen extraño clonado [18].

5.4. El número de copias del gen

Dado que el gen diana a menudo se incorpora a un sistema de vector plasmídico, la dosificación del gen depende del número de copias del plásmido. Como se puede esperar, un aumento en el número de copias da como resultado una productividad de proteína recombinante concomitantemente más alta, pero no de forma indefinida. El número de copias del plásmido se ve afectado por la genética del plásmido y del hospedador y también por las condiciones de cultivo, como las tasas de crecimiento, el medio y la temperatura [19].

5.5. Codones utilizados en genes extraños en comparación con el patrón normal de uso de codones en E. coli

Dado que los 20 aminoácidos están codificados por 61 codones de trinucleótidos diferentes, varios codones de trinucleótidos pueden codificar la información para la inserción del mismo aminoácido en la proteína. Los organismos muestran marcadas diferencias en la preferencia de codones. De hecho, parece que la frecuencia de uso de codones en un organismo es un reflejo directo del conjunto de ARNt afines [20]. Los genes altamente expresados ​​usan codones para los que existe una gran cantidad de ARNt afines, mientras que los genes reguladores a menudo usan codones para los que solo hay una pequeña cantidad de ARNt afines. En consecuencia, la expresión de un gen extraño puede estar limitada por la disponibilidad de un ARNt de aminoacilo particular [21].

El uso de codones por las diferentes especies puede ser bastante diferente. Como ejemplo, el uso de codones para la arginina de cuatro especies diferentes se presenta en la siguiente Tabla 2.

La sobreexpresión de genes con un alto contenido de codones raros puede resultar en una síntesis defectuosa de la enzima correspondiente. Además de la cantidad, la ubicación de codones raros dentro de la región de codificación puede influir significativamente en el nivel de traducción. Los codones raros cercanos al iniciador pueden detener el ribosoma e impedir la entrada de nuevos ribosomas entrantes [22].

5.5.1. Soluciones al problema del uso de codones

Hay dos soluciones experimentales para este problema: (1) aumento en la cantidad del ARNt afín apropiado, (2) alteración de estos codones a los usados ​​con frecuencia por mutagénesis específica de secuencia [22].

5.6. La estabilidad y eficiencia del ARNm

El ARNm de genes recombinantes tiende a acumularse en la célula, sin embargo, E. coli Los ARNm son bastante inestables. Algunas características del ARNm afectan su estabilidad. Estos incluyen (1) la secuencia Shine-Dalgarno (SD) en el extremo 5 'del ARNm que se cree que ayuda a posicionar el ARNm en el ribosoma, (2) la distancia entre la secuencia SD y el codón de iniciación, y (3 ) la estructura secundaria y terciaria del ARNm [7].

5.6.1. Soluciones

(1) Se informó recientemente que la adición de una secuencia de ADN específica corta (aproximadamente 89 pares de bases) al extremo distal de los genes clonados puede estabilizar el ARNm transcrito de ese gen, aumentando así la expresión del gen. Esta secuencia "retroreguladora" probablemente se incorpore en el extremo 3 'del ARNm, protegiéndolo de la digestión con exonucleasas [23]. (2) Se ha demostrado que las estructuras secundarias estables diseñadas en la región no traducida 5 'y el terminador independiente de rho 3' del ARNm pueden ayudar en la estabilidad del ARNm y prevenir la degradación por exonucleasas. En particular, una horquilla en el extremo 5 'sin ningún saliente de nucleótidos monocatenario 5' ha conferido ARNm con considerable resistencia a la actividad exonucleasa en el citoplasma [24].

5.7. La ubicación de la proteína clonada dentro del E. coli Celda

Tiempo E. coli Las proteínas se sintetizan en el citoplasma, es posible dirigir un producto génico clonado al citoplasma, la membrana interna o externa o el espacio periplásmico [25]. La secreción de un producto génico clonado al espacio periplásmico a menudo permite niveles más altos de expresión de la proteína extraña que podría ser degradada por proteasas en el citoplasma [26]. E. coli es capaz de reconocer y procesar correctamente secuencias de señales para que la secreción de enzimas en el E. coli el espacio periplásmico es posible [27].

5.7.1. Hay cuatro razones para trasladar proteínas recombinantes al periplasma

(1) el ambiente oxidante facilita la formación de enlaces disulfuro, (2) contiene solo el 4% de la proteína celular total (

100 proteínas diferentes), (3) hay menos degradación de proteínas y (4) fácil purificación por choque osmótico [3].

5.7.2. Desventaja de la expresión periplasmática

Si bien es técnicamente factible dirigir los productos proteicos de genes extraños a la membrana interna o externa, los niveles altos de una proteína extraña en la membrana pueden interferir con las funciones celulares normales y ser letales para la célula [28].

5.7.3. Solución

Recientemente se han construido vectores de expresión que colocan los genes de proteínas extrañas, normalmente no secretadas, detrás de un fragmento de ADN que codifica una secuencia señal. Esto da como resultado que la proteína extraña se secrete eficientemente (en grandes cantidades) al espacio periplásmico sin evidencia de acumulación de la forma no procesada en el citoplasma [29].

5.8. La estabilidad de la enzima clonada en E. coli

La secreción de un producto génico clonado al espacio periplásmico a menudo permite niveles más altos de expresión de la proteína extraña que podría ser degradada por proteasas en el citoplasma [26]. La producción a gran escala de proteínas eucariotas en E. coli a menudo está limitado por la inestabilidad de estos polipéptidos dentro del hospedador bacteriano [30].

La susceptibilidad a la proteasa puede verse afectada por las secuencias N- y C-terminales de la proteína recombinante. La presencia de Arg, Leu, Lys, Phe, Trp o Tyr en el extremo N se dirige a las proteínas para una degradación más rápida (regla del extremo N). Los aminoácidos no polares en el extremo C pueden conducir a una rápida degradación, sin embargo, las proteínas con los últimos cinco aminoácidos polares o cargados no se degradan [31].

Otros factores en la susceptibilidad a la proteasa incluyen (1) la presencia de productos proteicos dañados o en exceso causados ​​por la formación de polipéptidos incompletos, (2) síntesis excesiva de subunidades a partir de complejos multiméricos, (3) daño postraduccional o ingeniería genética de la proteína diana y (4) parámetros de crecimiento del cultivo, como la composición de nutrientes del medio, la temperatura de crecimiento y el pH [32].

5.8.1. Resolviendo el problema

(1) Una estrategia común que se ha utilizado para superar este problema es fusionar el gen de la proteína eucariota con una porción de un gen bacteriano [33]. (2) Un enfoque alternativo para estabilizar una proteína clonada es clonar múltiples copias del gen en tándem en el mismo plásmido [34].

5.9. Cuerpos de inclusión y cómo prevenir su formación

La producción rápida de proteínas recombinantes puede conducir a la formación de agregados insolubles designados como cuerpos de inclusión [35]. Se trata de partículas grandes y esféricas que están claramente separadas del citoplasma y son el resultado de la falla del sistema de control de calidad para reparar o eliminar las proteínas mal plegadas o desplegadas [36]. En este caso, puede resultar ventajoso clonar el gen en un vector de secreción para que la proteína clonada no se acumule en el citoplasma [37].

5.9.1. Soluciones

Las estrategias para prevenir la formación de cuerpos de inclusión tienen como objetivo ralentizar la producción de proteínas recombinantes e incluyen (1) vectores de bajo número de copias, (2) promotores débiles, (3) baja temperatura, (4) coexpresión de chaperonas moleculares, ( 5) uso de un socio solubilizante y (6) fermentación a valores extremos de pH [3]. (7) Una estrategia común que se ha utilizado para superar este problema es fusionar el gen de la proteína eucariota con una porción de un gen bacteriano [33].

Ventajas de las proteínas de expresión o heterólogas como proteínas de fusión o con etiqueta de proteína. Hay muchos vectores disponibles que permiten la expresión de proteínas heterólogas que se fusionan en sus parejas N- o C-terminales a menudo se denominan etiqueta de proteína [38]. Por ejemplo, la etiqueta de histidina (His) es una proteína de fusión. Estos socios de fusión ofrecen varias ventajas potenciales. Expresión mejorada: la fusión de los terminales N de una proteína heteróloga con el terminal C de un compañero de fusión altamente expresado a menudo permite un alto nivel de expresión de la proteína de fusión [39]. Solubilidad mejorada: la fusión del extremo N de una proteína heteróloga con el extremo C de un compañero de fusión soluble a menudo mejora la solubilidad de una proteína [40]. Detección mejorada: la fusión de una proteína en cualquier extremo a un péptido corto o un polipéptido que es reconocido por un anticuerpo o proteína de unión permite el análisis de transferencia Western de una proteína durante la expresión y purificación [41]. Purificación mejorada: es un fenómeno ampliamente utilizado. Se han descrito esquemas de purificación simples para proteínas fusionadas en cada extremo a etiquetas que se unen a resinas de afinidad. Las etiquetas disponibles incluyen His6 (seis residuos de histidina en tándem), que se unen a Ni-NTA (nitrilotriacetato quelado con iones Ni 2+) GST (glutatión-S-transferasa, que se unen a glutatión-sefarosa). Estas etiquetas se unen a sus resinas específicas y se separan fácilmente. No hay ningún efecto de las etiquetas sobre las proteínas y se extirpan fácilmente [42].

5.10. Plegado de proteínas correcto y eficiente

Durante o después de la traducción, el polipéptido debe plegarse para adoptar su conformación funcionalmente activa [43]. Dado que muchas proteínas desnaturalizadas se pueden replegar in vitro, parece que la información para el plegado correcto está contenida en la estructura del polipéptido primario [44]. Sin embargo, el plegamiento comprende etapas que limitan la velocidad durante las cuales algunas moléculas pueden agregarse, particularmente a altas velocidades de síntesis y a temperaturas más altas. A diferencia de las proteínas intracelulares, las proteínas secretadas naturalmente encuentran un entorno anormal en el citoplasma, la formación de enlaces disulfuro no se ve favorecida y no se puede producir la glicosilación [45].

5.10.1. Soluciones

(1) Coexpresar chaperones adicionales para ayudar en el plegamiento de proteínas. Esto puede causar una reducción en la expresión de la enzima, pero promueve la solubilidad. Existe evidencia de que ciertas proteínas de choque térmico actúan como chaperonas moleculares para prevenir la formación y acumulación de agregados desplegados, mientras aceleran las reacciones de plegamiento. (2) Para la formación de enlaces disulfuro, coexprese tiorredoxina (o utilícela como un socio de fusión) o use cepas deficientes en tiorredoxina reductasa. Una alternativa a considerar es dirigir la proteína al periplasma donde puede ocurrir la formación de enlaces disulfuro (la mayoría E. coli las proteínas que tienen enlaces disulfuro se encuentran en el periplasma) [46].

5.11. Características de crecimiento celular

Las características de crecimiento celular tienen una marcada influencia en la expresión de enzimas recombinantes. Algunas de las manipulaciones de los medios de cultivo son las siguientes. (a) Disminuir la temperatura de crecimiento de la cultura: las ventajas de una temperatura de crecimiento reducida son las siguientes. (1) El crecimiento a 37 ° C puede promover la formación de cuerpos de inclusión para algunas proteínas, mientras que el crecimiento a temperaturas más bajas (por ejemplo, 30 ° C, 25 ° C, 15 ° C) puede no hacerlo. (2) La temperatura más baja también disminuye la actividad de la proteasa. Las desventajas son las siguientes. (1) Hacer crecer el cultivo a una temperatura más baja ralentizará significativamente el crecimiento de E. coli, por lo que puede ser necesario un período de inducción más largo (por ejemplo, durante la noche) para obtener una cantidad suficiente de proteína recombinante. (2) Hacer crecer el cultivo a una temperatura más baja ralentizará la tasa de síntesis de proteínas, posiblemente evitando que las proteínas recombinantes saturen la maquinaria de plegamiento celular y se agreguen [47]. (B) Adición de cofactores: deben añadirse cofactores potenciales al medio de cultivo. Algunas proteínas no pueden plegarse correctamente sin su cofactor y, por lo tanto, pueden formar cuerpos de inclusión. (C) alteración del pH: la alteración del pH del medio de crecimiento puede mejorar la expresión. El pH es una variable de cultivo que puede afectar la actividad proteolítica, la secreción y los niveles de producción de proteínas [48].

5.12. Carga metabólica en el organismo

Independientemente de la naturaleza del gen extraño o del diseño del fermentador, la introducción de un plásmido exógeno en un E. coli la célula está destinada a imponer alguna carga metabólica [49].

5.12.1. Solución

Esto puede evitarse (1) integrando el gen extraño en el E. coli cromosoma mediante el uso de un lisógeno de bacteriófago lambda defectuoso que lleva el gen extraño [50], (2) mediante la inserción directa de un gen extraño en un sitio específico del cromosoma del huésped [51].

6. Conclusión

Mientras que la expresión eficiente de genes extraños en E. coli depende de una serie de factores, sin embargo, es razonable esperar que la mayoría de los genes extraños puedan expresarse en niveles altos en E. coli y que esta expresión se podrá ampliar. Aunque es probable que varíe la estrategia de expresión génica y ampliación, existen más similitudes que diferencias entre un gen y el siguiente, lo que da como resultado el desarrollo de un enfoque de "sistemas" para la clonación, expresión y ampliación de la enzima. genes en E. coli. El objetivo final de producir una proteína deseada en un hospedador heterólogo económico está influenciado por una variedad de factores. Sin embargo, maximizar la producción de proteínas heterólogas para aplicaciones comerciales es todavía un arte. Hemos comenzado a comprender los factores que influyen en la eventual producción. Estos factores, descritos en detalle en este documento, son variados y, en ocasiones, poco comprendidos. En gran parte, el enfoque sigue siendo empírico. Sin embargo, nuestra experiencia colectiva nos permitirá racionalizar nuestro enfoque en el diseño de la producción heteróloga de enzimas comercialmente importantes en una variedad de sistemas de expresión. Posteriormente a la producción, estabilización y formulación de proteínas, planteará obstáculos importantes en la utilización de catalizadores biológicos naturales y otras proteínas con fines terapéuticos e industriales.

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Derechos de autor

Copyright & # xa9 2013 Md. Fakruddin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.


Creando el clon

Los pasos de la clonación son los siguientes. El ADN se extrae del organismo en estudio y se corta en pequeños fragmentos de un tamaño adecuado para la clonación. La mayoría de las veces, esto se logra escindiendo el ADN con una enzima de restricción. Las enzimas de restricción se extraen de diferentes especies y cepas de bacterias, en las que actúan como mecanismos de defensa contra los virus. Se pueden considerar como "tijeras moleculares", que cortan el ADN en secuencias diana específicas. Las enzimas de restricción más útiles hacen cortes escalonados, es decir, dejan un saliente monocatenario en el sitio de la escisión. Estos salientes son muy útiles en la clonación porque los nucleótidos desapareados se emparejarán con otros salientes hechos usando la misma enzima de restricción. Por lo tanto, si el ADN del donante y el ADN del vector se cortan con la misma enzima, existe una gran posibilidad de que los fragmentos del donante y el vector cortado se empalmen debido a los salientes complementarios. La molécula resultante se llama ADN recombinante. Es recombinante en el sentido de que está compuesto de ADN de dos fuentes diferentes. Por lo tanto, es un tipo de ADN que sería imposible de forma natural y es un artefacto creado por la tecnología del ADN.

El siguiente paso en el proceso de clonación es cortar el vector con la misma enzima de restricción utilizada para cortar el ADN del donante. Los vectores tienen sitios diana para muchas enzimas de restricción diferentes, pero los más convenientes son aquellos que ocurren solo una vez en la molécula del vector. Esto se debe a que la enzima de restricción simplemente abre el anillo del vector, creando un espacio para la inserción del segmento de ADN del donante. El ADN del vector cortado y el ADN del donante se mezclan en un tubo de ensayo, y los extremos complementarios de ambos tipos de ADN se unen al azar. Por supuesto, son posibles varios tipos de uniones: fragmento de donante a fragmento de donante, fragmento de vector a fragmento de vector y, lo más importante, fragmento de vector a fragmento de donante, que puede seleccionarse. Las asociaciones de ADN recombinante se forman espontáneamente de la manera anterior, pero estas asociaciones no son estables porque, aunque los extremos están emparejados, la cadena principal de azúcar-fosfato del ADN no se ha sellado. Esto se logra mediante la aplicación de una enzima llamada ADN ligasa, que sella los dos segmentos, formando una doble hélice continua y estable.

La mezcla debería contener ahora una población de vectores, cada uno con un inserto de donante diferente. Esta solución se mezcla con células bacterianas vivas que han sido tratadas especialmente para hacer que sus células sean más permeables al ADN. Las moléculas recombinantes ingresan a las células vivas en un proceso llamado transformación. Por lo general, solo una única molécula recombinante entrará en cualquier célula bacteriana individual. Una vez dentro, la molécula de ADN recombinante se replica como cualquier otra molécula de ADN plasmídico, y posteriormente se producen muchas copias. Además, cuando la célula bacteriana se divide, todas las células hijas reciben el plásmido recombinante, que nuevamente se replica en cada célula hija.

La mezcla original de células bacterianas transformadas se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo en una placa plana (placa de Petri) para que las células se separen entre sí. Estas células individuales son invisibles a simple vista, pero a medida que cada célula experimenta rondas sucesivas de división celular, se forman colonias visibles. Cada colonia es un clon celular, pero también es un clon de ADN porque el vector recombinante ahora ha sido amplificado por replicación durante cada ronda de división celular. Por lo tanto, la placa de Petri, que puede contener muchos cientos de colonias distintas, representa una gran cantidad de clones de diferentes fragmentos de ADN. Esta colección de clones se denomina biblioteca de ADN. Al considerar el tamaño del genoma del donante y el tamaño promedio de los insertos en la molécula de ADN recombinante, un investigador puede calcular el número de clones necesarios para abarcar todo el genoma del donante o, en otras palabras, el número de clones necesarios para constituir una biblioteca genómica.

Otro tipo de biblioteca es una biblioteca de ADNc. La creación de una biblioteca de ADNc comienza con ácido ribonucleico mensajero (ARNm) en lugar de ADN. El ARN mensajero transporta información codificada del ADN a los ribosomas para su traducción en proteínas. Para crear una biblioteca de ADNc, estas moléculas de ARNm se tratan con la enzima transcriptasa inversa, que se utiliza para hacer una copia de ADN de un ARNm. Las moléculas de ADN resultantes se denominan ADN complementario (ADNc). Una biblioteca de ADNc representa una muestra de los genes transcritos, mientras que una biblioteca genómica incluye regiones no transcritas.

Tanto las bibliotecas genómicas como las de ADNc se elaboran sin tener en cuenta la obtención de fragmentos de donantes clonados funcionales. Los clones genómicos no contienen necesariamente copias completas de genes. Además, el ADN genómico de eucariotas (células u organismos que tienen un núcleo) contiene intrones, que son regiones de ADN que no se traducen en proteínas y no pueden ser procesadas por células bacterianas. Esto significa que incluso los genes de tamaño completo no se traducen en su totalidad. Además, las señales reguladoras eucariotas son diferentes de las que utilizan los procariotas (células u organismos que carecen de membranas internas, es decir, bacterias). Sin embargo, es posible producir bibliotecas de expresión cortando insertos de ADNc inmediatamente adyacentes a una región promotora bacteriana en el vector en estas bibliotecas de expresión, las proteínas eucariotas se producen en células bacterianas, lo que permite varias aplicaciones tecnológicas importantes que se discuten a continuación en la secuenciación de ADN.

También se han utilizado como vectores varios virus bacterianos. El más utilizado es el fago lambda. La parte central del genoma lambda no es esencial para que el virus se replique en Escherichia coli, por lo que esto se puede escindir usando una enzima de restricción apropiada, y los insertos de ADN del donante se pueden empalmar en el espacio. De hecho, cuando el fago vuelve a empaquetar el ADN en su cápsula de proteína, solo incluye fragmentos de ADN de la misma longitud que el genoma del fago normal.

Los vectores se eligen en función de la cantidad total de ADN que debe incluirse en una biblioteca. Los cósmidos son vectores diseñados que son híbridos de plásmido y fago lambda; sin embargo, pueden llevar insertos más grandes que los plásmidos pUC (plásmidos diseñados para producir un número muy alto de copias de ADN pero que pueden acomodar solo insertos pequeños) o el fago lambda solo. Los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son vectores basados ​​en plásmidos de factor F (factor de fertilidad) de E. coli y puede transportar cantidades mucho mayores de ADN. Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) son vectores basados ​​en plásmidos de replicación autónoma de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería). En la levadura (un organismo eucariota), un YAC se comporta como un cromosoma de levadura y se segrega adecuadamente en células hijas. Estos vectores pueden transportar los insertos más grandes de todos y se utilizan ampliamente en la clonación de genomas grandes, como el genoma humano.


Ver el vídeo: Clonación in silico de genes por PCR (Enero 2022).