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6.1D: PAMP bacterianos acidorresistentes - Biología

6.1D: PAMP bacterianos acidorresistentes - Biología


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Objetivos de aprendizaje

  1. Nombre los PAMP comunes asociados con bacterias acidorresistentes que estimulan la producción de citocinas y una respuesta inflamatoria.
  2. Nombre las bacterias ácido-resistentes patógenas 2 e indique la infección que causa cada una.

Para protegerse contra la infección, una de las cosas que el cuerpo debe hacer inicialmente es detectar la presencia de microorganismos. El cuerpo hace esto reconociendo moléculas exclusivas de los microorganismos que no están asociados con las células humanas. Estas moléculas únicas se denominan patrones moleculares asociados a patógenos o PAMP. (Debido a que todos los microbios, no solo los microbios patógenos, poseen PAMP, los patrones moleculares asociados a patógenos a veces se denominan patrones moleculares asociados a microbios o MAMP).

Las moléculas exclusivas de las bacterias, como los monómeros de peptidoglicano, los ácidos teicoicos, los LPS, las porinas, el ácido micólico, el arabinogalactano, los glicanos ricos en manosa y la flagelina son PAMP que se unen a los receptores de reconocimiento de patrones en una variedad de células de defensa del cuerpo, lo que las hace sintetizan y secretan una variedad de proteínas llamadas citocinas. Estas citocinas pueden, a su vez, promover defensas inmunitarias innatas como inflamación, fiebre y fagocitosis. La unión de PAMPS a PRR también conduce a la activación de las vías del complemento y la activación de la vía de la coagulación.

Las citocinas son proteínas reguladoras intercelulares producidas por una célula que posteriormente se unen a otras células del área e influyen en su actividad de alguna manera. Las citocinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), la interleucina 1 (IL-1), la interleucina 6 (IL-6) y la interleucina 8 (IL-8) se conocen como citocinas inflamatorias. (def) porque promueven la inflamación. Algunas citocinas, como IL-8, también se conocen como quimiocinas. Promueven una respuesta inflamatoria al permitir que los glóbulos blancos abandonen los vasos sanguíneos y entren en el tejido circundante, atrayendo quimiotácticamente estos glóbulos blancos al sitio de la infección y haciendo que los neutrófilos liberen agentes destructores para la destrucción extracelular.

La lisis de patógenos Mycobacterium especies, como Tuberculosis micobacteriana (inf)y Mycobacterium leprae (inf), libera fragmentos de ácido micólico, arabinogalactano y peptidoglicano (dipéptidos de muramilo) de su pared celular acidorresistente (ver Figura ( PageIndex {1} )). Las moléculas de ácido micólico, arabinogalactano y fragmentos de peptidoglicano se unen a receptores de reconocimiento de patrones en macrófagos. (def) y células dendríticas (def) haciendo que liberen citocinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa). Se cree que la mayor parte del daño en los pulmones durante la tuberculosis se debe a los efectos del TNF-alfa junto con la liberación de componentes lisosomales tóxicos de los macrófagos que intentan matar el Tuberculosis micobacteriana.

Resumen

  1. Los PAMP asociados con bacterias acidorresistentes incluyen ácido micólico, arabinogalactano y fragmentos de peptidoglicano.
  2. Las bacterias acidorresistentes de importancia médica incluyen Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae.

Preguntas

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  1. ____________________ (ans) y _____________________ (ans) son los componentes de la pared celular acidorresistente que estimulan la producción de citocinas y una respuesta inflamatoria.
  2. Nombre 2 bacterias ácido-resistentes patógenas e indique la infección que causa cada una.
    1. (ans)
    2. (ans)
  3. Opción multiple (ans)

El receptor EF-Tu de Arabidopsis mejora la resistencia a las enfermedades bacterianas en el trigo transgénico

La primera línea de defensa activa en el sistema inmunológico de las plantas implica el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (o microbios), PAMP (o MAMP) por receptores de reconocimiento de patrones transmembrana (PRR) (Boller & Felix, 2009 Schwessinger & Ronald, 2012 Zipfel , 2014). Tras la detección por PRR, se inician una serie de reacciones de defensa que conducen a la inmunidad activada por PAMP (PTI), que se cree que es suficiente para repeler la mayoría de los microbios. Los patógenos exitosos tienen que evadir o suprimir PTI, y comúnmente lo hacen empleando proteínas efectoras. Estos efectores, a su vez, pueden ser reconocidos por las proteínas de resistencia vegetal (R), lo que da como resultado una fuerte reacción de defensa descrita como inmunidad activada por efectores (ETI) (Dodds y Rathjen, 2010). los RLa resistencia mediada por genes se ha utilizado ampliamente en el mejoramiento de trigo y otros cultivos. Mientras que muchos R-los genes proporcionan una resistencia casi completa a razas de patógenos específicos, pueden volverse fácilmente ineficaces a medida que los patógenos mutan o pierden el efector único que reconocen. La mayoría de R-los genes derivados del trigo se han vuelto ineficaces debido a la aparición de nuevas razas de patógenos (Keller et al., 2000 Boyd et al., 2013 Dangl et al., 2013). El riesgo de RLa degradación de genes ha animado a los criadores a buscar formas de resistencia más duraderas.

Los PAMP son moléculas importantes conservadas en taxones microbianos que no se pueden eliminar o mutar fácilmente. Por tanto, la resistencia basada en PTI es potencialmente duradera y de amplio espectro (Roux et al., 2014). Se han descrito varios pares de PAMP-PRR y se están investigando cada vez más en especies de cultivos (Schwessinger & Ronald, 2012 Kawano & Shimamoto, 2013 Wu & Zhou, 2013). Por ejemplo, la quitina es un componente importante de las paredes celulares de los hongos que comúnmente es el objetivo de los sistemas de defensa de las plantas (Hamel y Beaudoin, 2010). En Arabidopsis (Arabidopsis thaliana, At) la quinasa del receptor del dominio LysM (RK) QUINASA 1 DEL RECEPTOR ELICITADOR DE QUITINA (CERK1) es la PRR para la quitina (Miya et al., 2007 Wan et al., 2008). En arroz (Oryza sativa, Os), tanto la proteína tipo receptor que contiene el dominio LysM (RLP), la PROTEÍNA DE UNIÓN ELICITADOR DE QUITINA (CEBiP) como la CERK1 son necesarias para el reconocimiento de la quitina y para mediar la resistencia a los patógenos fúngicos (Kaku et al., 2006 Kishimoto et al., 2010 Shimizu et al., 2010 Mentlak et al., 2012 Shinya et al., 2012 Hayafune et al., 2014 Kouzai et al., 2014a, b). Curiosamente, CEBiP y CERK1 también juegan un papel importante en el reconocimiento de quitina y la resistencia a los hongos en el trigo (Lee et al., 2014). Además, el silenciamiento del CEBiP Ortólogo en la cebada aumenta la susceptibilidad al hongo. Magnaporthe oryzae (Tanaka et al., 2010), lo que sugiere que CEBiP también puede estar involucrado en la percepción de quitina en esta especie de cultivo. Los PAMP bacterianos mejor caracterizados reconocidos por las plantas son flg22, un epítopo dentro de la región más conservada de flagelina bacteriana (Felix et al., 1999) y elf18, un epítopo dentro del factor de elongación bacteriano Tu (EF-Tu) (Kunze et al., 2004). FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2) pertenece a la repetición rica en leucina (LRR) -RK familia XII y reconoce flg22 en Arabidopsis, arroz, tomate, soja y vid (Gomez-Gomez & Boller, 2000 Robatzek et al., 2007 Takai et al., 2008 Valdés-López et al., 2011 Trda et al., 2014). Arabidopsis EF-TU RECEPTOR (EFR) también pertenece a la familia LRR-RK XII, pero reconoce elf18 y está restringido a Brassicaceae (Zipfel et al., 2006 Boller y Felix, 2009 Lloyd et al., 2014). Recientemente, se ha informado que el arroz puede reconocer el EF-Tu bacteriano a través de un epítopo que no sea elf18, pero actualmente se desconoce el PRR correspondiente (Furukawa et al., 2014). Dentro de las especies de plantas monocotiledóneas, el arroz Xa21 también pertenece a la familia LRR-RK XII y confiere una resistencia duradera a la enfermedad del tizón bacteriano causada por Xanthomonas oryzae pv. oryzae, a través del reconocimiento de un PAMP aún no identificado (canción et al., 1995 Bahar et al., 2014 ).

Dado que PTI contribuye a la resistencia basal y no huésped y la percepción de PAMP media en el reconocimiento de clases completas de microbios, la transferencia de PRR podría conferir resistencia a los patógenos actuales en los cultivos al introducir el reconocimiento de epítopos no detectados previamente. De hecho, se ha demostrado que la expresión de PRR individual aumenta la resistencia a patógenos fúngicos y bacterianos, incluso en las clases de monocotiledóneas y dicotiledóneas, como AtEFR en tomate (Lacombe et al., 2010), y OsXa21 en naranja, tomate, plátano y Arabidopsis (Mendes et al., 2010 Afroz et al., 2011 Tripathi et al., 2014 Holton et al., 2015). Para probar si EFR podría conferir capacidad de respuesta elf18 en trigo, primero establecimos métodos para evaluar las respuestas de PAMP en este cultivo usando flg22 y quitina. Luego creamos plantas de trigo transgénicas que expresan AtEFR, y demostró que esto confiere capacidad de respuesta a elf18 y una mayor resistencia a Pseudomonas syringae pv. oryzae, un patógeno bacteriano de los cereales que causa el tizón del halo (Kuwata, 1985 Rudolph & von Kietzell, 1997).


S. epidermidis & # x02013 la especie

Los estafilococos son colonizadores bacterianos comunes de la piel y las membranas mucosas de los seres humanos y otros mamíferos 4. S. epidermidis en particular, es la especie más frecuentemente aislada del epitelio humano. Coloniza predominantemente axilas, cabeza y fosas nasales 5. Análisis de la S. epidermidis El genoma indicó que la especie está bien equipada con genes que se supone que brindan protección contra las duras condiciones que se encuentran en su hábitat natural 9, 10. Por ejemplo, para hacer frente a concentraciones extremas de sal y presión osmótica, S. epidermidis tiene ocho intercambiadores de iones / protones de sodio y seis sistemas de transporte de osmoprotectores 9.

S. epidermidis Pertenece al grupo de estafilococos coagulasa negativos (CoNS), que se distingue de los estafilococos coagulasa positivos como S. aureus al carecer de la enzima coagulasa. La especie muestra un alto grado de diversidad con 74 tipos de secuencia identificados (ST) 6. La mayoría de los aislamientos pertenecen al complejo clonal (CC) 2, que comprende el ST2 aislado con mayor frecuencia. Posiblemente, la propagación exitosa de ST2 puede deberse al hecho de que todos los aislados de ST2 contienen secuencias de inserción de IS256 y ica genes 7, dos factores encontrados correlacionados con S. epidermidis invasividad 13 & # x02013 16. Además, la mayoría de las cepas de ST2 muestran in vitro capacidad para formar biopelículas 7. La información del genoma está disponible para dos cepas de S. epidermidis: el biofilm negativo ATCC12228 8 y el aislado clínico biofilm positivo RP62A 9. Es de destacar que todavía no se dispone de una secuencia del genoma para un aislado del ST2 más frecuente y potencialmente más invasivo.


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Las señales inmunes dan forma a las comunidades de raíces

Para frustrar los patógenos microbianos en la superficie, la planta Arabidopsis activa la señalización defensiva con ácido salicílico. En Arabidopsis plantas con sistemas inmunitarios modificados, Lebeis et al. muestran que las comunidades bacterianas también cambian en respuesta a la señalización del ácido salicílico en la zona de la raíz (ver Perspectiva de Haney y Ausubel). La abundancia de algunas familias de bacterias colonizadoras de raíces aumentó a expensas de otras, en parte en función de si el ácido salicílico se utilizó como señal inmunitaria o como fuente de carbono para el crecimiento microbiano.

Ciencias, este número p. 860 ver también p. 788


Virulencia viral

Aunque los patógenos virales no son similares a los patógenos bacterianos en términos de estructura, algunas de las propiedades que contribuyen a su virulencia son similares. Uso de virus adhesinas para facilitar la adhesión a las células del huésped, y ciertos virus envueltos dependen de la variación antigénica para evitar las defensas inmunitarias del huésped. Estos factores de virulencia se analizan con más detalle en las siguientes secciones.

Adhesinas virales

Uno de los primeros pasos en cualquier infección viral es la adhesión del virus a receptores específicos en la superficie de las células. Este proceso está mediado por adhesinas que son parte del cápside viral o envoltura de membrana. La interacción de adhesinas virales con receptores celulares específicos define el tropismo (focalización preferencial) de virus para células, tejidos y órganos específicos del cuerpo. La proteína de la espiga hemaglutinina encontrado en Virus de la gripe es un ejemplo de adhesina viral que permite que el virus se una al ácido siálico en la membrana de las células respiratorias e intestinales del huésped. Otra adhesina viral es la glicoproteína gp20, que se encuentra en VIH. Para que el VIH infecte las células del sistema inmunológico, debe interactuar con dos receptores en la superficie de las células. La primera interacción implica la unión entre gp120 y el marcador celular CD4 que se encuentra en algunas células esenciales del sistema inmunológico. Sin embargo, antes de que pueda ocurrir la entrada viral en la célula, debe ocurrir una segunda interacción entre gp120 y uno de los dos receptores de quimiocinas (CCR5 y CXCR4). La Tabla 6 enumera las adhesinas para algunos patógenos virales comunes y los sitios específicos a los que estas adhesinas permiten que los virus se adhieran.

Tabla 6. Algunas adhesinas virales y sus sitios de fijación del hospedador
Patógeno Enfermedad Adhesin Sitio adjunto
Virus de la gripe Influenza Hemaglutinina Ácido siálico de las células respiratorias e intestinales.
Virus del herpes simple I o II Herpes oral, herpes genital Glicoproteínas gB, gC, gD Sulfato de heparán en las superficies mucosas de la boca y los genitales
Virus de inmunodeficiencia humana VIH / SIDA Glicoproteína gp120 CD4 y CCR5 o CXCR4 de las células del sistema inmunológico

Variación antigénica en virus

La variación antigénica también ocurre en ciertos tipos de virus envueltos, incluidos los virus de la influenza, que exhiben dos formas de variación antigénica: deriva antigénica y cambio antigénico (Figura 9). La deriva antigénica es el resultado de mutaciones puntuales que provocan ligeros cambios en las proteínas de la espiga. hemaglutinina (Mano neuraminidasa (NORTE). Por otro lado, el cambio antigénico es un cambio importante en las proteínas de pico debido al reordenamiento de genes. Este reordenamiento para el cambio antigénico ocurre típicamente cuando dos virus de influenza diferentes infectan al mismo hospedador.

La tasa de variación antigénica en los virus de la influenza es muy alta, lo que dificulta que el sistema inmunológico reconozca las muchas cepas diferentes de virus de la influenza. Aunque el cuerpo puede desarrollar inmunidad a una cepa a través de la exposición natural o la vacunación, la variación antigénica da como resultado la aparición continua de nuevas cepas que el sistema inmunológico no reconocerá. Ésta es la razón principal por la que las vacunas contra el virus de la influenza deben administrarse anualmente. Cada año vacuna contra la influenza proporciona protección contra las cepas más prevalentes para ese año, pero las cepas nuevas o diferentes pueden ser más prevalentes el año siguiente.

Figura 9. Deriva antigénica y cambio antigénico en los virus de la influenza. (a) En la deriva antigénica, las mutaciones en los genes de las proteínas de superficie neuraminidasa y / o hemaglutinina dan como resultado pequeños cambios antigénicos a lo largo del tiempo. (b) En el cambio antigénico, la infección simultánea de una célula con dos virus de influenza diferentes da como resultado la mezcla de genes. El virus resultante posee una mezcla de proteínas de los virus originales. Las pandemias de influenza a menudo se pueden atribuir a cambios antigénicos.

Para obtener otra explicación de cómo se producen el cambio y la deriva antigénicos, mire este video.

Piénsalo

  • Describe el papel de las adhesinas en el tropismo viral.
  • Explique la diferencia entre deriva antigénica y desplazamiento antigénico.

Conceptos clave y resumen

  • Factores virulentos contribuyen a la capacidad de un patógeno para causar enfermedades.
  • Exoenzimas y toxinas permitir que los patógenos invadan el tejido del huésped y causen daño tisular. Las exoenzimas se clasifican según la macromolécula a la que se dirigen y las exotoxinas se clasifican según su mecanismo de acción.
  • Las toxinas bacterianas incluyen endotoxina y exotoxinas. La endotoxina es el componente lípido A del LPS de la envoltura celular gramnegativa. Las exotoxinas son proteínas secretadas principalmente por bacterias grampositivas, pero también son secretadas por bacterias gramnegativas.
  • Los patógenos bacterianos pueden evadir la respuesta inmune del huésped produciendo cápsulas para evitar la fagocitosis, sobrevivir al entorno intracelular de los fagocitos, degradar los anticuerpos o mediante variación antigénica.
  • Los patógenos virales utilizan adhesinas para iniciar infecciones y variación antigénica para evitar las defensas inmunitarias.
  • Los virus de la influenza usan ambos deriva antigénica y cambio antigénico para evitar ser reconocido por el sistema inmunológico.

Opción multiple

¿Cuál de los siguientes sería un factor de virulencia de un patógeno?

  1. una proteína de superficie que permite que el patógeno se una a las células huésped
  2. un huésped secundario que el patógeno puede infectar
  3. una proteína de superficie que el sistema inmunológico del huésped reconoce
  4. la capacidad de formar un provirus

Recientemente ha identificado una nueva toxina. Es producida por una bacteria gramnegativa. Está compuesto principalmente de proteínas, tiene una alta toxicidad y no es estable al calor. También descubre que se dirige a las células del hígado. Con base en estas características, ¿cómo clasificaría esta toxina?

¿Cuál de las siguientes opciones se aplica a la hialuronidasa?

  1. Actúa como factor de propagación.
  2. Favorece la coagulación sanguínea.
  3. Es un ejemplo de adhesina.
  4. Es producido por células inmunes para atacar patógenos.

¿Cuál de las siguientes funciones son las fosfolipasas?

  1. degradar anticuerpos
  2. promover la propagación de patógenos a través del tejido conectivo.
  3. degradar el ácido nucleico para promover la propagación del patógeno
  4. degradar las membranas celulares para permitir que los patógenos escapen de los fagosomas

Complete el espacio en blanco

La adhesión de la glicoproteína gp120 en el VIH debe interactuar con __________ en algunas células inmunes como primer paso en el proceso de infectar la célula.

Las adhesinas generalmente se encuentran en __________ del patógeno y se componen principalmente de __________ y ​​__________.

Las toxinas Shiga y difteria se dirigen a __________ en las células hospedadoras.

El __________ antigénico es el resultado de la reordenación de genes responsables de la producción de proteínas de pico del virus de la influenza entre diferentes partículas de virus mientras están en el mismo huésped, mientras que el __________ antigénico es el resultado de mutaciones puntuales en las proteínas de pico.


Laboratorio virtual de identificación bacteriana

Este laboratorio modular e interactivo explora las técnicas utilizadas para identificar diferentes tipos de bacterias en función de sus secuencias de ADN.

En este laboratorio, los estudiantes preparan y analizan una muestra virtual de ADN bacteriano. En el proceso, aprenden sobre varios métodos comunes de biología molecular, que incluyen extracción de ADN, PCR, electroforesis en gel y secuenciación y análisis de ADN. Estos métodos son aplicables en una amplia variedad de entornos, incluida la investigación científica y los laboratorios forenses.

El laboratorio contiene un espacio de laboratorio interactivo y un cuaderno informativo con procedimientos detallados. También incluye recursos complementarios, como un glosario de términos científicos, imágenes de equipos y herramientas y una enciclopedia de bacterias.

La hoja de trabajo adjunta proporciona estructura y orientación a medida que los estudiantes realizan los procedimientos en el laboratorio.

El vínculo "Carpeta de recursos de Google" dirige a una carpeta de Google Drive de documentos de recursos en el formato de Google Docs. Es posible que no todos los documentos descargables del recurso estén disponibles en este formato. La carpeta de Google Drive está configurada como "Solo ver" para guardar una copia de un documento en esta carpeta en su Google Drive, abra ese documento y luego seleccione Archivo → "Hacer una copia". Estos documentos se pueden copiar, modificar y distribuir en línea siguiendo los Términos de uso que se enumeran en la sección "Detalles" a continuación, incluida la acreditación de BioInteractive.


Estructura y composición de microbios ☆

Envoltura de células bacterianas acidorresistentes

La envoltura de células bacterianas resistentes a los ácidos es una derivación especializada de la envoltura de células Gram-positivas que tiene un contenido de lípidos extremadamente alto. Las bacterias acidorresistentes incluyen Micobacterias y algunos de los Nocardia. La propiedad de tinción ácido-resistente resulta de la presencia de glicolípidos de membrana y ácidos grasos 2-alquil-3-hidroxi de cadena muy larga (ácidos micólicos) unidos al peptidoglicano. En las micobacterias, hasta el 60% del peso seco de la envoltura celular consiste en lípidos.

La estructura básica de la envoltura ácido-resistente es: membrana citoplasmática → capa gruesa de peptidoglicano → polisacárido de arabinogalactano (AG) único → ácidos micólicos → glicolípidos, ceras, sulfolípidos y glicerofosfolípidos. El peptidoglicano está altamente reticulado y está unido covalentemente a AG. AG está esterificado con los ácidos micólicos y cubierto por un prospecto de los lípidos extraíbles. La capa compleja de AG, ácidos micólicos y lípidos forma una pseudo-membrana externa que a veces se denomina "micomembrana". Esta estructura se completa con proteínas de porina para facilitar la absorción de nutrientes por parte de la célula.


Afiliaciones

Departamento de Biología Evolutiva, Universidad de Firenze, via Romana 17, I-50125, Firenze, Italia

Marco Galardini, Marco Bazzicalupo y amp Alessio Mengoni

Instituto de Investigación Interdisciplinaria USR3078 - CNRS-University of Lille 1 - Université de Lille 2, Villenenuve d'Ascq, Francia

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Autor correspondiente


Un enfoque de laboratorio para la microbiología

Parte 9 Influencias ambientales y control del crecimiento microbiano
9.1. Efecto del oxígeno sobre el crecimiento
9.2. Temperatura
9.3. pH y crecimiento microbiano
9.4. Presión hidrostática y osmótica
9.5. Luz ultravioleta
9.6. El efecto de la lisozima en las células bacterianas
9.7. Evaluación de desinfectantes
9.8. Evaluación de antisépticos
9.9. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos

Parte 10 Microbiología alimentaria
10.1. Deterioro microbiano de alimentos
10.2. Deterioro microbiano de alimentos enlatados

Parte 11 Examen bacteriológico del agua

Parte 12 Lavado de manos eficaz

Parte 13 Clasificación bacteriana

Parte 14 Serología y Hematología

Parte 15 Identificación de bacterias desconocidas
15.1. Cultivos de stock
15.2. Caracterización fisiológica de las bacterias desconocidas
15.3. Prueba de fermentación
15.4. Carbohidratos en Durham Tubes
15.5. Fermentación de ácidos mixtos (prueba de rojo de metilo)
15.6. 2, 3 Fermentación con butanodiol (prueba de Voges-Proskauer)
15.7. Prueba de citrato
15.8. Prueba de catalasa
15.9. Reducción de nitratos
15.10. Prueba de hidrólisis de almidón y azul espíritu
15.11. Hidrólisis de grasas
15.12. Degradación del triptófano
15.13. Hidrólisis de urea
15.14. Medio SIM
15.15. Leche de tornasol
15.16. Determinación de estafilococos a partir de otras bacterias

Parte 16 Referencias

EYOB WALLANO

Dr. Eyob Wanorie Wallano, obtuvo su Doctorado en Medicina Veterinaria en el Instituto Veterinario de Jarkov, Jarkov, URSS. Su especialidad se centró en la biología molecular con especialización en genética bacteriana e inmunoquímica en la Escuela Nacional de Veterinaria de Lyon y el Instituto Pasteur en Lyon, Francia. El Dr. Wallano pasó la mayor parte de su vida profesional en la producción de vacunas bacterianas y la investigación de enfermedades. También se dedicó a la investigación del cáncer de pulmón y de mama en la Universidad de California, Los Ángeles, en el Departamento de Patología Humana y Medicina Animal de Laboratorio. Luego, el Dr. Wallano persiguió sus aspiraciones de enseñanza relacionadas con las ciencias ambientales, la biología, la anatomía, la fisiología y la microbiología en varias instituciones que incluyen: Los Angeles City College, Cleveland Chiropractic College y Compton College, donde ahora es profesor de tiempo completo en 12 años. años.

En Compton College, el Dr. Wallano recibió el premio distinguido de la facultad por su contribución y creación del simposio de investigación científica que involucró a cientos de estudiantes que participaron en investigación básica desde 2015. El Dr. Wallano también está involucrado en otras actividades profesionales que involucran la producción de antifúngicos contra infecciones cutáneas.

Las décadas de experiencia del Dr. Wallano en la producción de vacunas, la investigación de enfermedades y la experiencia docente lo inspiraron a crear un manual de laboratorio de microbiología para ayudar a sus estudiantes a tener éxito, especialmente a aquellos que continuarán su educación en profesiones relacionadas con la salud. Los miles de estudiantes a quienes el Dr. Wallano ha enseñado validan su pasión por la enseñanza y su amor por los estudiantes para abrazar la ciencia. Muchos de sus estudiantes están de acuerdo en que el estilo de enseñanza del Dr. Wallano les dio el dominio de las muchas materias que ha enseñado.


Reconocimiento de patógenos y activación de la respuesta inmune innata en el pez cebra

El pez cebra ha demostrado ser un excelente modelo para estudiar la inmunidad innata de los vertebrados. Nos presenta posibilidades para en vivo obtención de imágenes de interacciones huésped-patógeno que no tienen paralelo en sistemas de modelos de mamíferos. Además, su idoneidad para los enfoques genéticos está proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos que subyacen a la respuesta inmune innata. Aquí, revisamos los receptores de reconocimiento de patrones que identifican a los microbios invasores, así como los mecanismos efectores inmunes innatos que activan en los embriones de pez cebra. Comparamos el conocimiento actual sobre estos procesos en modelos de mamíferos y peces cebra y discutimos estudios recientes utilizando modelos de infección de pez cebra que han avanzado nuestra comprensión general del sistema inmunológico innato. Además, utilizamos el análisis del transcriptoma del pez cebra infectado con E. tarda, S. typhimurium, y M. marinum para visualizar los perfiles de expresión génica que resultan de estas infecciones. Nuestros datos ilustran que los dos patógenos causantes de enfermedades agudas, E. tarda y S. typhimurium, provocan un perfil de inducción de genes proinflamatorios muy similar, mientras que el patógeno causante de enfermedades crónicas, M. marinum, induce una respuesta inmune innata más débil y retardada.

1. Introducción

El uso de pez cebra adulto (Danio rerio) y su descendencia transparente como hospedadores para modelar enfermedades infecciosas causadas por patógenos humanos o patógenos animales estrechamente relacionados, ha proporcionado recientemente nuevos conocimientos sobre la patogénesis, que en muchos casos no podrían haberse logrado utilizando modelos de mamíferos [1-6]. El poder del modelo de pez cebra radica en su idoneidad para enfoques genéticos, detección de alto rendimiento y estudios de imágenes en vivo. Actualmente se dispone de líneas transgénicas marcadas con fluoróforos que permiten una visualización sin precedentes de las interacciones de patógenos con macrófagos y neutrófilos, los principales tipos de células inmunitarias innatas fagocíticas de las larvas de pez cebra [7-11]. Tan pronto como un día después de la fertilización (dpf), los embriones de pez cebra muestran actividad fagocítica hacia infecciones microbianas [12] y pueden montar una respuesta inmune innata con una firma transcripcional que se asemeja a las respuestas en sistemas de cultivo celular o de mamíferos [13]. La inmunidad adaptativa se activa después de aproximadamente tres semanas de desarrollo [14]. Por lo tanto, la inmunidad innata se puede estudiar durante las primeras etapas embrionarias y larvarias del pez cebra en ausencia de respuestas de células T y B. En este artículo nos centramos en las vías de señalización implicadas en el reconocimiento de patógenos y la activación de la respuesta inmune innata en embriones y larvas de pez cebra. Comparamos el conocimiento del sistema inmunológico innato del pez cebra con el de modelos humanos y mamíferos y discutimos los resultados de los análisis transcriptómicos que muestran una clara especificidad en las respuestas a diferentes patógenos bacterianos, como Salmonela y Micobacterias especies.

2. Receptores de reconocimiento de patrones

El sistema inmunológico innato es la primera línea de defensa del huésped contra la infección, por lo tanto, su función principal es reconocer los patógenos invasores de manera temprana y desencadenar una respuesta proinflamatoria adecuada [15]. El sistema inmunológico innato utiliza un número limitado de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) codificados en la línea germinal para reconocer estructuras conservadas evolutivas en patógenos, denominados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) [15]. Los PRR también son capaces de detectar indirectamente la presencia de patógenos [16, 17]. Esto ocurre cuando la infección, la inflamación u otras tensiones celulares hacen que los factores del huésped estén presentes en ubicaciones aberrantes o formen complejos moleculares anormales, los llamados patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) [17]. Los PRR ubicados en la superficie celular están explorando el entorno extracelular en busca de microbios. Los PRR localizados en endosomas identifican microbios que han entrado en la vía de degradación fagolisosómica, y los PRR citoplásmicos reconocen patógenos citosólicos intracelulares o componentes de microbios internalizados [18]. Tras el reconocimiento de PAMP, los PRR señalan la presencia de infección e inician respuestas proinflamatorias y antimicrobianas mediante la activación de varias vías de señalización intracelular [19], lo que finalmente conduce a la activación de la expresión génica y la síntesis de una amplia gama de moléculas. Estos incluyen citocinas proinflamatorias y quimiotácticas y péptidos antimicrobianos [20]. Las diferentes familias de PRR presentes tanto en humanos como en peces cebra y sus vías de señalización aguas abajo se resumen en la Figura 1 y se discutirán a continuación.


Receptores de reconocimiento de patrones y mecanismos efectores del sistema inmunológico innato. La localización de Tlrs en la superficie celular o en endosomas es hipotética y se basa en las funciones conocidas o propuestas de sus homólogos en otros peces o mamíferos. La capacidad de los PRR (representados en verde) para reconocer los PAMP presentes en varios tipos de microorganismos, como bacterias, virus y hongos, se ha simplificado aquí al representar a los microorganismos como bacterias en forma de varilla (en azul). El reconocimiento de PAMP por PRR conduce a la activación de factores de transcripción (TF), que se trasladan al núcleo e inician la transcripción de genes de citocinas, genes antimicrobianos y otros genes relacionados con la inmunidad. Los mecanismos de defensa como la autofagia, la producción de ROS y NO y la desgranulación pueden activarse inmediatamente tras el reconocimiento microbiano, sin la transcripción de genes de novo.
2.1. Receptores tipo Toll

La clase de PRR más estudiada son los receptores tipo Toll (TLR), una familia de 10 proteínas en humanos. Los TLR reciben el nombre de Drosophila Proteína de peaje, que actúa en el patrón dorsoventral y en las respuestas antifúngicas [23]. Los TLR son glicoproteínas integrales que poseen un dominio de unión a ligando extracelular o luminal con motivos de repetición rica en leucina (LRR) y un dominio de homología del receptor de señalización citoplasmática Toll / Interleucina-1 (IL-1) (TIR) ​​[20, 24]. En los mamíferos, los principales tipos de células que expresan los TLR son las células presentadoras de antígenos (APC), que incluyen macrófagos y células dendríticas, y linfocitos B [18]. Sin embargo, la mayoría de los tipos de células son capaces de expresar TLR, por ejemplo, en respuesta a una infección localizada [25]. En los mamíferos, TLR4 reconoce las bacterias Gram negativas a través de la porción de lípido A del lipopolisacárido (LPS), mientras que TLR2 reconoce las bacterias Gram positivas a través del ácido lipoteicoico (LTA), las lipoproteínas y el peptidoglicano, y TLR5 reconoce la proteína flagelina del aparato de motilidad, que puede estar presente en ambos tipos de Gram [18]. Otros TLR están especializados en reconocer ácidos nucleares en compartimentos endosomales y fagosómicos. TLR3 puede detectar la replicación viral al unirse a ARN bicatenario (dsRNA), TLR7 y TLR8 reconocen específicamente el ARN monocatenario (ssRNA) de virus de ARN, y el ADN CpG no metilado presente en los genomas de virus y bacterias es detectado por TLR9 [18 ]. La unión del ligando por un TLR lo inducirá a formar oligómeros homoméricos o heteroméricos, lo que desencadena la transducción de señales intracelulares a través de sus dominios TIR [18]. La vía de señalización de TLR de mamíferos utiliza cinco moléculas adaptadoras que contienen dominios TIR diferentes: MYD88, MAL / TIRAP, TRIF / TICAM1, TRAM / TICAM2 y SARM [19, 24]. Entre estos, MYD88 es el adaptador más universal, ya que todos los TLR lo utilizan para la señalización descendente, con la excepción de TLR3 [26]. La señalización aguas abajo a través de moléculas intermedias centrales como TRAF6 eventualmente conducirá a la activación de factores de transcripción, principalmente miembros de ATF, NF

Familias B, AP-1, IRF y STAT, que regulan la expresión de una batería de genes antimicrobianos y proinflamatorios [26].

Se han identificado supuestos ortólogos de TLR de mamíferos en el pez cebra, además de algunos miembros de la familia de peces específicos [27, 28]. Una duplicación del genoma durante la evolución de los peces teleósteos probablemente explica por qué el pez cebra tiene dos contrapartes para algunos de los TLR de mamíferos (p. Ej., tlr4ba / tlr4bb por TLR4 y tlr5a / tlr5b por TLR5), pero aún se desconoce si este aumento en el número de receptores está asociado con la diversificación en el reconocimiento de PAMP [4]. Actualmente sólo se conocen algunos de los ligandos TLR del pez cebra [29]. La especificidad de TLR2, TLR3 y TLR5 se conserva entre mamíferos y peces, reconociendo lipopéptidos, dsRNA y flagelina, respectivamente [13, 30, 31]. Además, se ha demostrado que el TLR22 específico de peces reconoce dsRNA y PolyI: C [31]. Sin embargo, el pez cebra TLR4 no puede ser estimulado por LPS, lo que ilustra que no todas las especificidades de ligando se conservan entre los mamíferos y el pez cebra [32, 33]. También se han identificado en el pez cebra intermedios de señalización en la vía aguas abajo de los TLR de mamíferos, incluidos los homólogos de cuatro de las proteínas adaptadoras, Myd88, Mal / Tirap, Trif / Ticam1 y Sarm, y el intermedio central Traf6 [34]. Entre estos, Myd88 y Traf6 se han estudiado funcionalmente mediante análisis de caída en embriones de pez cebra, mostrando su necesidad de una respuesta inmune innata proinflamatoria a la presencia microbiana [13, 35-37]. Además, la activación de la respuesta inmune innata en embriones de pez cebra también conduce a la inducción de miembros de las familias de factores de transcripción ATF, NF B, AP-1, IRF y STAT [13, 38].

2.2. Receptores tipo NOD

Los patógenos que escapan a la vigilancia de la superficie celular y los PRR endosomales pueden terminar en el citosol, donde los receptores similares al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD) (NLR) detectan su presencia mediante PAMP y DAMP intracelulares [39]. Los NLR constituyen una familia de 23 proteínas en humanos. Sus características definitorias son la presencia de un dominio NOD ubicado centralmente responsable de la oligomerización, un LRR C-terminal capaz de unirse al ligando y un dominio de interacción proteína-proteína N-terminal, como el dominio de reclutamiento de caspasa (CARD), pirina ( PYD), o dominio de repetición del inhibidor de baculovirus (BIR) [40]. Dos de los NLR, NOD1 y NOD2, pueden detectar la presencia de bacterias detectando directa o indirectamente moléculas producidas durante la síntesis o descomposición del peptidoglicano [40]. NOD1 reconoce el ácido gD-glutamil-meso-diaminopimélico (iE-DAP), un dipéptido producido principalmente por bacterias Gram-negativas, mientras que NOD2 puede reconocer ambos tipos de Gram, ya que se activa al unirse al dipéptido de muramil (MDP), un componente de peptidoglicano [41, 42]. Curiosamente, tanto NOD1 como NOD2 se han implicado recientemente en la detección de parásitos que carecen de peptidoglicano, lo que indica que estos receptores pueden reconocer una gama más amplia de patógenos de lo que se suponía originalmente [43, 44]. Tras la unión del ligando, NOD1 y NOD2 reclutan la serina / treonina quinasa RIPK2 (también conocida como RIP2) a través de interacciones CARD-CARD, lo que finalmente conduce a la activación de NF B [45, 46]. Además, la estimulación NOD1 / 2 también induce la señalización de MAP quinasa [47]. Sinérgicamente, con la activación de TLR, las cascadas de señalización de NOD1 / 2 inducen la expresión de citocinas y quimiocinas, como TNF, IL6, IL8, IL10 e IL12, así como la producción de péptidos antimicrobianos [46, 48, 49].

Otros NLR, como IPAF, NALP1 y NALP3, funcionan principalmente para crear un complejo multiproteico conocido como inflamasoma, en el que se asocian con un adaptador llamado ASC (proteína tipo mota asociada a la apoptosis que contiene una CARD) y con la procaspasa 1 [ 50]. La oligomerización de las proteínas en un inflamasoma a través de interacciones CARD-CARD finalmente conduce a la escisión de la procaspasa 1 en su forma activa, caspasa 1, que luego está disponible para catalizar la escisión de la pro-IL1 acumulada.β y pro-IL18 en sus formas secretadas, IL1 biológicamente activaβ e IL18 [40]. El miembro de la familia NLR incorporado en estos complejos determina qué PAMP y DAMP son reconocidos por el inflamasoma. Se ha establecido un papel para NALP3 en el reconocimiento de ATP [51], cristales de ácido úrico [52], ARN viral [53] y ADN bacteriano [54]. Tanto NALP1 como NALP3 comparten la capacidad de NOD2 para responder a MDP [55]. Además, NALP1 puede asociarse con NOD2 (Hsu 2008), lo que muestra un papel para NOD2 en IL1 desencadenada por MDPβ activación, separada de su papel como inductor de la expresión de genes proinflamatorios.

Aunque la función de los miembros de la familia NLR en el pez cebra no se ha estudiado ampliamente, se sabe que se conservan los miembros canónicos de la familia NLR de mamíferos, NOD1, NOD2 y NOD3 (o Nlrc3). Además, están presentes una subfamilia de NLR que se asemejan a los NALP de mamíferos y una subfamilia única de NLR de teleósteos [34, 56]. La confirmación del papel antibacteriano de NOD1 y NOD2 en el pez cebra se logró mediante la eliminación de genes, lo que resulta en una mayor carga bacteriana y una disminución de la supervivencia de los embriones después de Salmonella enterica infección [57]. Es más, asentir1 / 2 el agotamiento disminuyó significativamente la expresión de oxidasa dual (DUOX), necesaria para la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) [57].Estos hallazgos ilustran que la familia de receptores tipo Nod y sus vías de señalización aguas abajo son importantes para la inmunidad innata antibacteriana, tanto en mamíferos como en pez cebra.

2.3. Receptores tipo RIG-I

Otra familia de PRR citosólicos, los receptores tipo RIG-I (RLR), consta de tres miembros: RIG-I (gen I inducible por ácido retinoico), MDA5 (factor 5 asociado a la diferenciación del melanoma) y LGP2 (laboratorio de genética y fisiología 2). Los tres miembros son helicasas de ARN de caja DExD / H que pueden detectar la presencia de ARN de una amplia gama de virus [58]. Aunque se expresa en niveles bajos en la mayoría de los tejidos, su expresión aumenta enormemente con las infecciones virales o la exposición al interferón (IFN) [59, 60]. El dominio de ARN helicasa de los RLR tiene la capacidad de hidrolizar ATP y unirse al ARN [61]. Además, RIG-I y MDA5 contienen un tándem de CARD, que facilitan las interacciones proteína-proteína [60]. LGP2 carece de las dos CARD y se cree que funciona como un regulador negativo de la señalización RIG-I y MDA5 [62]. Tras el reconocimiento del ARN viral, las CARD de RIG-I y MDA5 están disponibles para unirse a un adaptador de señalización mitocondrial común, IPS-1 o MAVS [63]. La cascada de señalización subsiguiente culmina en la inducción de factores de transcripción como el factor regulador de interferón 3 (IRF3), IRF7 y NF B [64]. La activación de estos factores de transcripción conduce a la producción de IFN tipo I, que se une al receptor de IFN para iniciar la expresión de genes estimulados por interferón (ISG) [65]. Entre estos ISG se encuentran las proteínas antivirales, los componentes del proteasoma inmunitario, los tres RLR, los miembros de la familia TLR, los factores de transcripción como el IRF7 y diversas citocinas y quimiocinas proinflamatorias [65]. Como tal, la vía inducida por RLR trabaja en cooperación con la señalización de TLR para preparar la célula para la eliminación de infecciones virales [58].

Se identificaron homólogos de pez cebra de RIG-I, MDA5 y DXH58 en una búsqueda del genoma [66]. Sin embargo, en silico El análisis de las proteínas predichas reveló que la distribución de dominios difiere entre los seres humanos y el pez cebra [66]. Por ejemplo, mientras que el RIG-I humano contiene dos CARD, un dominio DExD / H y un dominio de Helicasa C, el RIG-I de pez cebra consta de una sola CARD y un dominio DExD / H [66]. Si bien los estudios funcionales de la vía RLR son escasos, está claro que el pez cebra y otros teleósteos poseen un fuerte sistema antiviral de IFN, que comparte un origen evolutivo común con los mamíferos [67, 68]. El adaptador RLR mitocondrial, IPS-1 / MAVS, se clonó recientemente a partir de salmón y pez cebra, y la sobreexpresión en células de peces condujo a una inducción constitutiva de ISG [68]. Además, MITA, otro adaptador que funciona corriente abajo de IPS-1 / MAVS y corriente arriba de la quinasa de unión a tanque 1 (TBK1), se clonó a partir de carpa cruciana (Carassius auratus) y ha demostrado activar construcciones de genes promotores de IFN de pez cebra, dependientes de IRF3 o IRF7 [69].

2.4. Receptores carroñeros

Los receptores carroñeros son una gran familia de receptores de superficie celular transmembrana, presentes en macrófagos, células dendríticas, mastocitos [70] y algunos tipos de células endoteliales y epiteliales [71]. Aunque originalmente se definieron por su papel en la captación de lipoproteínas de baja densidad (LDL), ahora se sabe que actúan como PRR para una amplia variedad de PAMP, como LPS, LTA, ADN CpG, zimosán de levadura y proteínas de superficie microbiana [72]. . Comúnmente, la unión de PAMP a un receptor eliminador inducirá a la célula a fagocitar directamente al patógeno [73]. La regulación al alza de la expresión del receptor eliminador a través de la señalización de TLR puede ser un mecanismo para aumentar la actividad fagocítica [74]. Además, los receptores captadores también pueden contribuir a la producción de citocinas como correceptores de los TLR [75, 76]. Algunas de las lectinas de tipo C, que se analizan a continuación, también muestran actividad de receptor depurador.

Según su estructura multidominio, los receptores depuradores se dividen en ocho subclases (A-H) (Murphy 2005). Las subclases A y B son las más estudiadas, pero también se ha demostrado que los miembros de otras subclases reconocen los PAMP bacterianos [72]. SR-A, el miembro fundador de la subclase A, funciona como receptor fagocítico para patógenos bacterianos como Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides, Neumonía por estreptococo, y Escherichia coli [77-79]. Receptor de macrófagos con estructura de colágeno (MARCO), otro miembro de la subclase A con actividad PRR establecida [80], funciona como receptor fagocítico para S. neumonía [81] y norte. meningitidis [82]. Se demostró que MARCO coopera con TLR2 para desencadenar respuestas de citocinas de macrófagos al glicolípido trehalosa dimicolato (TDM) de la pared celular micobacteriana y Tuberculosis micobacteriana [83]. CD36, el miembro más destacado de la subclase B, es un sensor de LTA y lipopéptido diacilado (MALP-2) y también actúa como correceptor de TLR2 [75]. Fagocitosis mediada por CD36 de S. aureus se demostró que era necesario para el inicio de la señalización TLR2 / 6 [84]. SR-BI (o CLA-1), también en la subclase B, puede unirse a LPS y estuvo implicado en la fagocitosis de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas [85]. Además de sus funciones antibacterianas, CD36 y SR-BI también son conocidos por aumentar la patogénesis del virus de la malaria y la hepatitis C (VHC). CD36 puede funcionar como receptor de eritrocitos parasitados por Plasmodium falciparum, adhiriendo estas células al endotelio venular de varios órganos (Pluddemann 2007). Además, SR-BI es utilizado por Plasmodium esporozoitos y VHC como sitio de entrada a los hepatocitos [72].

En el genoma del pez cebra se pueden identificar muchos homólogos de la familia del receptor eliminador de mamíferos, pero aún se espera un análisis sistemático. Un homólogo de pez cebra de MARCO humano fue identificado como un marcador específico para macrófagos y células dendríticas de pez cebra adulto [86], y este gen también es mieloide específico en embriones de pez cebra [87]. Expresión de la cd36 El gen se incrementó después de exponer al pez cebra al rabdovirus septicemia hemorrágica [88]. A diferencia de, cd36 expresión fue regulada negativamente por Mycobacterium marinum Infección en larvas y peces cebra adultos [22].

2.5. Lectinas tipo C

Los receptores de lectina de tipo C (CLR) son una gran familia de proteínas de unión a carbohidratos que están muy conservadas entre los mamíferos [89]. La diversidad de la familia CLR se ilustra por el hecho de que hasta 17 grupos están presentes en los vertebrados, algunos consisten en proteínas séricas solubles, mientras que otros consisten en proteínas transmembrana. Estos se expresan principalmente en células mieloides (macrófagos y células dendríticas), pero también en células asesinas naturales [90, 91]. El CLR más conocido en suero es la lectina fijadora de manosa (MBL), un miembro de la clase de la colectina, que se une a una variedad de restos de azúcar presentes en virus, bacterias, hongos y protozoos y activa el sistema del complemento [92]. En términos de su función como PRR, los CLR transmembrana que se expresan en células mieloides son los más interesantes. Los CLR transmembrana se pueden dividir en dos grupos: la familia de receptores de manosa y la familia de receptores de asialoglicoproteínas [93]. Los CLR reconocen patógenos principalmente a través de la unión de ligandos a estructuras de carbohidratos de manosa, fucosa y glucano, lo que significa que juntos son capaces de reconocer la mayoría de las clases de patógenos humanos [93]. Al igual que los receptores depuradores, los CLR pueden actuar como receptores fagocíticos para bacterias no opsonizadas, lo que lleva a su destrucción en fagolisosomas acidificados [73]. El miembro mejor estudiado de la familia de receptores de asialoglicoproteínas es Dectin-1, que media la fagocitosis de la levadura y la proteína zymosan derivada de la levadura [94]. La fagocitosis inducida por CLR como Dectin-1 no solo es importante para la degradación lisosómica de patógenos, sino también para la presentación de antígenos [95, 96]. Además de su papel en la fagocitosis, los CLR pueden inducir directamente la expresión génica tras el reconocimiento de carbohidratos. El reconocimiento de PAMP por Dectin-1, Dectin-2 y lectina de tipo C inducible por macrófagos (Mincle) conduce finalmente a la activación de NF B [97-99]. Donde Dectin-1 se asocia con la quinasa Syk para activar NF B [100], Dectin-2 y Mincle dependen del receptor Fc Υ-cadena como molécula adaptadora [98, 99]. Otros CLR, por ejemplo, la nonintegrina capturadora de ICAM3 específica de DC (DC-SIGN), inducen perfiles de expresión génica específicos tras el reconocimiento de patógenos mediante la modulación de la señalización de TLR [93]. Cuando DC-SIGN reconoce restos de manosa o fucosa en patógenos como Micobacterias, VIH-1, virus del sarampión y Candida albicans, activa una vía de señalización dependiente de Raf-1 que modula la activación de NF B inducida por TLR, aumentando la producción de IL8 y la producción de IL10 antiinflamatoria [101].

Solo se han descrito unos pocos homólogos de CLR en el pez cebra. Un homólogo de la lectina de unión a manosa (MBL) que activa el complemento se asoció con la resistencia contra Listonella anguillarum [102]. Expresión de otra lectina soluble, lgals91l, está enriquecido en células mieloides embrionarias de pez cebra y depende del factor de transcripción Spi1 / Pu.1 que juega un papel crucial en el desarrollo de células mieloides en vertebrados [87]. Se demostró que una colectina de tipo membrana, CL-P1 (colectina placenta 1), participa en la vasculogénesis durante la embriogénesis del pez cebra [103]. En los seres humanos, CL-P1 se expresa principalmente en las células endoteliales vasculares y se ha demostrado que actúa como un receptor eliminador que media la fagocitosis de bacterias y levaduras [104]. Recientemente se ha propuesto un homólogo putativo de DC-SIGN y se regula al alza en tejidos relacionados con el sistema inmunitario después de la infección por Aeromonas anguillarum [105]. Por último, se han identificado supuestos homólogos de los receptores de células NK de lectina de tipo C de mamíferos en el pez cebra y se expresan de forma diferencial en las células de los linajes mieloide y linfoide [106].

3. Mecanismos efectores de la respuesta inmune innata en el pez cebra

Mientras que el sistema inmunológico adaptativo requiere varios días antes de reaccionar a los microbios invasores, el sistema inmunológico innato consiste principalmente en defensas que están constitutivamente presentes y se activan inmediatamente después de la infección (Figura 1). La respuesta inflamatoria general es un mecanismo de defensa innato crucial. Un estado de inflamación es necesario para el funcionamiento adecuado de las defensas del huésped, ya que se centra en las células inmunitarias circulantes y los componentes antimicrobianos del plasma en el sitio de la infección. A continuación, nos centramos en los mecanismos efectores implicados en la parte mediada por células de la respuesta inmune innata. Además, las proteínas séricas solubles, incluidos los factores del complemento y otras proteínas de fase aguda, hacen una contribución importante a las defensas innatas, y se ha observado una fuerte inducción de sus genes codificantes en modelos de infección de pez cebra embrionario y adulto [13, 36, 38, 107-109].

3.1. Péptidos secretados y mediadores lipídicos de la respuesta inmune innata

Las citocinas, incluidas las interleucinas, las quimiocinas y los interferones, son pequeñas proteínas secretadas que dirigen el sistema inmunológico del huésped hacia una respuesta citotóxica, humoral, mediada por células o alérgica [110]. Dado que este artículo se centra en la inmunidad innata, analizaremos principalmente las citocinas producidas o que actúan sobre las células fagocíticas. Se puede hacer una distinción entre citocinas que promueven un estado de inflamación y citocinas que son antiinflamatorias. Las principales citocinas proinflamatorias producidas por los fagocitos son el TNFα, IL1α, IL1β, IL6 e IL8 [110]. TNF-α se procesa como una proteína unida a la membrana y, cuando es necesario, el factor soluble activo es escindido por el TNF-α enzima convertidora (TACE) [111]. Del mismo modo, IL1α y IL1β se sintetizan como precursores inactivos que sólo se secretan como citocinas activas después de la escisión mediada por el inflamasoma por la caspasa 1 [112]. La citocina antiinflamatoria más potente en los seres humanos es la IL10, que desactiva la producción de citocinas proinflamatorias por los macrófagos y las células T [113]. El equilibrio IL10 / IL12, mantenido por las células del sistema inmunológico innato, determina si la inmunidad adaptativa se polariza hacia una respuesta Th1 (promovida por IL12) o Th2. Una respuesta Th1, que activa las actividades bactericidas de los macrófagos, es la más importante para controlar los patógenos intracelulares. El IFN único de tipo II, IFNγ, también se requiere para activar las funciones bactericidas de los macrófagos, mientras que los IFN de tipo I (IFNα e IFNβ) y tipo III IFN (IFNλ) funcionan en el montaje de respuestas antivirales. Por último, los mediadores de lípidos eicosanoides también promueven (p. Ej., Prostaglandinas y leucotrienos) o inhiben (p. Ej., Lipoxinas) la inflamación, lo que sinergiza o antagoniza las funciones de las citocinas.

Muchas de las subfamilias de citocinas se conservan entre el pez cebra y los mamíferos [34]. Sin embargo, ha habido una amplia expansión y diversificación de los miembros de la familia de genes de las quimiocinas en el pez cebra, y sus funciones específicas aún no se han determinado [114]. Varias de las principales citocinas, como IL1β, IL6 e IL10, se han clonado y caracterizado [115-117]. Además, el pez cebra homólogo del receptor 1 de interleucina 10 (IL10R1) ha sido identificado recientemente y parece contener todos los dominios proteicos necesarios para su función en la señalización antiinflamatoria [118]. La quimiocina proinflamatoria IL8 (CXCL8) y sus receptores, CXCR1 y CXCR2, también se conservan entre los mamíferos y el pez cebra [119]. Además, se ha identificado un segundo linaje IL8 / CXCL8 tanto en el pez cebra como en la carpa común (Cyprinus carpio), y las propiedades quimiotácticas de las moléculas de carpa IL8 / CXCL8 de ambos linajes fueron demostradas por in vitro Ensayos de quimiotaxis con leucocitos de carpa [120]. Tanto las citocinas proinflamatorias como las antiinflamatorias se regulan positivamente tras la infección de embriones de pez cebra con patógenos como S. tifimurio [13], PAG. aeruginosa [121], y mi. tarda [122, 123].

El papel del TNF durante Mycobacterium marinum La infección de embriones de pez cebra se estudió mediante análisis de caída del receptor de TNF (tnfrsf1a), que reveló que las cargas bacterianas intracelulares, la formación de granulomas y la muerte necrótica de los macrófagos aumentan en ausencia de señalización de TNF [124]. La importancia de la señalización de TNF durante METRO. marinum La infección se ilustró aún más cuando se usó el mismo modelo para mostrar que un equilibrio estricto entre el TNF proinflamatorio y las lipoxinas antiinflamatorias es vital para el control de las infecciones por micobacterias, ya sea con demasiada o muy poca expresión de TNF que conduce a un resultado más severo de la enfermedad [1]. Otro estudio que utiliza el modelo de pez cebra indica que TNF-α es un potente activador de las células endoteliales, que conduce a la producción de quimiocinas, mientras que tiene poco efecto sobre el estado de activación de los fagocitos [125]. Esto sugiere que los peces TNF-α Funciona principalmente en el reclutamiento de leucocitos al sitio de infección, en lugar de activarlos.

Los tres grupos de IFN presentes en los seres humanos no se conservan de forma inequívoca en el pez cebra y otras especies de peces. El grupo de IFN de tipo II en el pez cebra consiste en IFNγ1 e IFNγ2 [126]. Los niveles de expresión de los genes correspondientes no cambiaron tras la infección de embriones de pez cebra con mi. coli o Y. ruckeri, pero se incrementó en METRO. marinum infección [126, 127]. La infección viral indujo su expresión en el pez cebra adulto, pero no en los embriones [126]. IFNγ1 e IFNγSe demostró que 2 se unían a diferentes complejos de receptores, y se demostró que la quinasa Janus 2a (Jak2a), pero no Jak2b, era necesaria para la transmisión intracelular del IFNγ señal. Dos grupos de IFN antivirales, llamados IFN

1 e IFN 2, existen en el pez cebra, y el análisis estructural mostró que estos son evolutivamente más cercanos a los IFN humanos de tipo I que a los de tipo III [34, 67, 128]. La señal de IFN 1 e IFN 2 a través de distintos complejos de receptores [67, 129]. Todos los genes de IFN del pez cebra inducen la expresión de genes que se prevé que participen en actividades antivirales [67].

3.2. Fagocitosis, autofagia y destrucción lisosomal

La internalización de microorganismos se desencadena cuando son reconocidos por receptores fagocíticos, principalmente por receptores depuradores discutidos anteriormente. Este tipo de fagocitosis directa se denomina fagocitosis no opsónica, mientras que la fagocitosis opsónica se basa en proteínas derivadas del hospedador que recubren la superficie del microbio, aumentando así la eficacia de la fagocitosis. Las opsoninas incluyen fragmentos del complemento, sobre todo C3b, que son reconocidos por los receptores del complemento [130]. La lectina de unión a manosa, que puede iniciar la formación de C3b, y los anticuerpos que se unen a los receptores Fc (IgG) o que activan el complemento (IgM) también se consideran opsoninas. Independientemente del receptor que inicie el proceso, la fagocitosis requiere la activación de quinasas y GTPasas Rab que controlan las alteraciones en la membrana fosfolipídica y la remodelación del citoesqueleto de actina [131]. En los macrófagos, la fusión de la vesícula resultante con endosomas tempranos y tardíos disminuirá el pH del fagosoma inmaduro y alterará las proteínas presentes en su membrana. En última instancia, los fagosomas que maduran se convierten en fagolisosomas cuando los lisosomas se fusionan con ellos, mezclando su contenido [132]. Los lisosomas son vesículas endocíticas altamente ácidas (

), que contiene proteasas y lipasas activas, y enzimas hidrolíticas como la catepsina D [133]. Además, los fagolisosomas también contienen péptidos bactericidas (defensinas) y tienen la capacidad de generar compuestos oxidativos tóxicos que ayudan a la degradación microbiana [134]. La mayor parte de nuestro conocimiento sobre la maduración del fagosoma proviene de estudios de fagocitosis en macrófagos, y se sabe mucho menos sobre la maduración del fagosoma en neutrófilos. Mientras que los fagosomas de macrófagos se fusionan con endosomas y lisosomas, los fagosomas de neutrófilos obtienen sus propiedades bactericidas al fusionarse con vesículas secretoras y gránulos [135, 136]. A diferencia de la maduración de los fagosomas en los macrófagos, los fagosomas de los neutrófilos no se acidifican para convertirse en microbicidas [135, 136].

Muchos patógenos intracelulares, como METRO. tuberculosis, S. tifimurio, y Legionella pneumophila, han desarrollado la capacidad de prevenir la maduración del fagosoma en los macrófagos y sobrevivir dentro de estas vesículas [137]. Hasta cierto punto, estos patógenos también pueden resistir el entorno hostil del (fago) lisosoma. Otros patógenos como Listeria monocytogenes, Francisella tularensisy muchos virus pueden escapar del fagosoma y entrar en el citosol [138]. Mycobacterium marinum, un patógeno estudiado extensamente en el pez cebra para modelar la tuberculosis humana, puede sobrevivir dentro de los fagosomas pero también escapar al citosol y diseminarse a las células vecinas mediante la motilidad basada en actina [139, 140]. También se ha observado un escape fagosómico del patógeno humano. METRO. tuberculosis y depende de un factor de virulencia, el sistema de secreción ESX- / RD1, compartido por todas las micobacterias patógenas [141]. Juntos, estos datos indican que las células huésped se enfrentan a numerosos patógenos que han desarrollado múltiples estrategias para evitar la vía de degradación fagolisosómica. Para contrarrestar estas amenazas, las células pueden utilizar la autofagia para eliminar los microbios y las vesículas que contienen microbios del citosol. La autofagia es bien conocida como un proceso metabólico que recicla nutrientes degradando orgánulos y proteínas intracelulares.Sólo recientemente, se ha reconocido que la autofagia también juega un papel importante en la respuesta inmune innata contra patógenos intracelulares [142]. La autofagia se inicia cuando se forma una membrana de aislamiento autofagosomal alrededor de su objetivo, encerrándola por completo en una vesícula de doble membrana. Este proceso se basa en la fosfatidilinositol 3-quinasa de clase III (PI3-quinasa) y genes relacionados con la autofagia (Atgs), como Atg6 (o Beclin-1) [143]. El sello distintivo de los autofagosomas es la presencia de Atg8 (o LC3) en sus membranas, que es esencial para el alargamiento de la membrana [144]. Similar a un fagosoma en maduración, el autofagosoma también se fusiona con los lisosomas para lograr sus propiedades degradativas [145]. Además, los autolisosomas adquieren propiedades antimicrobianas únicas debido a la función de la proteína adaptadora autofágica p62, que entrega componentes citosólicos a los autolisosomas donde se procesan en potentes péptidos antimicrobianos [146]. Como se revisó en otra parte [147], la autofagia dirigida a patógenos puede ser inducida por varios TLR y NLR, TNF-α, NF B y muchas otras moléculas de señalización relacionadas con el sistema inmunológico.

La transparencia de los embriones de pez cebra y la disponibilidad de líneas indicadoras de neutrófilos y macrófagos fluorescentes permiten estudiar el proceso de fagocitosis con gran detalle [7, 148-150]. Recientemente se demostró que los macrófagos embrionarios de pez cebra engullen eficientemente mi. coli bacterias de cavidades llenas de sangre y líquido, mientras que los neutrófilos apenas son capaces de fagocitar las bacterias presentes en los líquidos [150]. Sin embargo, los neutrófilos demostraron ser altamente fagocíticos cuando se movían sobre las bacterias presentes en las superficies de los tejidos. Esto muestra que el tipo de célula inmunitaria que elimina una infección no solo depende de los PAMP presentes en el microbio invasor, sino también de las características del sitio de la infección. Un en vivo Se utilizó un ensayo de fagocitosis para demostrar que las funciones de Wasp1, Wasp2, Abi2 y el regulador de cofilina 14-3-3ζ (Ywab) en la fagocitosis bacteriana se conservan en el pez cebra [151]. La reciente generación de una línea de pez cebra transgénico con LC3 etiquetado con GFP ha permitido en vivo visualización de las interacciones entre microbios y este componente central de la maquinaria de autofagia [152]. La importancia de la autofagia en la respuesta inmune innata del pez cebra aún no se ha estudiado, pero hemos demostrado que las estructuras marcadas con LC3 se acumulan alrededor METRO. marinum sitios de infección en embriones de pez cebra (Figura 2). Además, se indujeron genes relacionados con la autofagia en peces cebra adultos infectados con Citrobacter freundii y embriones de pez cebra infectados con S. tifimurio [37, 153].


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(C) En el lugar detección de autofagia por acumulación de Lc3. Se inyectaron embriones de pez cebra [15] transgénicos CMV :: LC3-GFP (28 hpf) en la vena caudal con 200 unidades formadoras de colonias (UFC) de METRO. marinum Mma20 expresando un vector pMST3 :: mCherry. Se tomaron imágenes confocales de una región de la cola de la larva en desarrollo a los 3 días después de la infección (3 dpi), un punto en el que el METRO. marinum Se ha establecido la infección (a). Se pueden observar niveles bajos de señal de Lc3-GFP (b) en todas las células, mientras que las regiones más brillantes (indicadas por puntas de flecha) solo se observan tras la acumulación de Lc3 y la formación de membranas autofágicas asociadas con bacterias (c). Barra de escala: 10
3.3. Defensas oxidativas en leucocitos

En varios sistemas, se ha demostrado que los neutrófilos son las primeras células inmunitarias que llegan al sitio de la infección o la herida. Facilitan su migración exocitando gránulos que contienen metaloproteinasas y otras enzimas que degradan la matriz extracelular [154]. Tras el reconocimiento de los patógenos, los neutrófilos liberan sus gránulos antimicrobianos, llamados azurófilos, en los fagosomas o en el entorno extracelular [155, 156]. Los azurófilos están repletos de hidrolasas ácidas y proteínas antimicrobianas, como lisozima, catepsinas y mieloperoxidasa (MPO) [157]. La función principal de MPO es reaccionar con peróxido de hidrógeno (H2O2), que posteriormente oxida el cloruro, la tirosina y el nitrito para formar ácido hipoclórico (HOCl), radicales de tirosina e intermedios de nitrógeno reactivo [158]. Estos productos químicos altamente reactivos atacan las membranas superficiales de los microbios. Además, los microbios pueden unirse mediante trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son redes fibrosas de proteínas granulares y cromatina liberadas por los neutrófilos [159].

Si bien la MPO se produce principalmente en los neutrófilos, todos los fagocitos profesionales producen altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), incluido el superóxido, H2O2y radicales hidroxilo, producidos por las enzimas NADPH oxidasa (NOX) y oxidasa dual (DUOX) [160]. El NOX de los fagocitos (Phox) solo se activa tras la exposición a microorganismos u otros estímulos proinflamatorios [161]. Cuando está activo, Phox se localiza en la membrana fagosómica y cataliza el estallido respiratorio, que consiste en la producción a gran escala de ROS que ayuda a degradar los microbios fagocitados mediante la oxidación inespecífica de proteínas, ADN, lípidos y carbohidratos [162]. H2O2 producido durante el estallido respiratorio también puede funcionar como un sustrato para la actividad de MPO. La enzima oxidativa DUOX puede incluso combinar las dos funciones, al generar H2O2 como sustrato para su propio dominio peroxidasa [160].

El óxido nítrico (NO) se produce a partir del aminoácido L-arginina por las enzimas de óxido nítrico sintasa (NOS) y funciona como una molécula de señalización en numerosos procesos biológicos, además de tener actividad antimicrobiana [163]. Hay dos enzimas NOS expresadas constitutivamente, NOS neuronal (nNOS o NOS1) y NOS endotelial (eNOS o NOS3), y una NOS inducible (iNOS o NOS2) que es importante en la inmunidad innata. La regulación de NOS2 juega un papel importante en la respuesta inflamatoria, y muchas células del sistema inmunológico son capaces de producir NO [164, 165]. El NO tiene efectos antimicrobianos citostáticos y citotóxicos cuando las células inmunes excretan grandes cantidades en los tejidos de los mamíferos, muy probablemente a través de especies de nitrógeno reactivo (RNS) que se generan cuando el NO interactúa con O2 [166]. Estos RNS conducen posteriormente a peroxidación de lípidos, daño del ADN, oxidación de tioles y nitración de residuos de tirosina [167]. Recientemente se ha demostrado que Nos2a, el homólogo de pez cebra de NOS2, también es necesario para la expansión de las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras durante la infección, lo que lleva a un mayor número de células inmunitarias necesarias [168]. Este descubrimiento se suma a la importancia de NOS2 en la respuesta inflamatoria.

Los mecanismos de defensa oxidativa deben controlarse estrictamente, ya que los altos niveles de sustancias químicas reactivas como ROS y RNS causan daño tisular en los sitios de infección. Por lo tanto, la fase de resolución de la inflamación es fundamental para restaurar el tejido a su estado normal y prevenir la inflamación crónica. Las moléculas producidas durante las defensas oxidativas a menudo son autolimitadas y ayudan a iniciar la resolución de la inflamación al inducir la apoptosis de los neutrófilos [160, 169]. Además, la producción de NO inducida por iNOS puede contrarrestarse mediante la activación de la arginasa (ARG), que agota el sustrato para iNOS al convertir la L-arginina en los compuestos inocuos urea y L-ornitina, creando así condiciones más favorables para la cicatrización de heridas [163, 170].

El homólogo de pez cebra de MPO, oficialmente llamado MPX, se expresa específicamente en neutrófilos durante el desarrollo embrionario. Líneas informadoras transgénicas impulsadas por la mpx promotor han hecho del pez cebra un organismo modelo muy adecuado para estudiar la inflamación neutrofílica [8, 171]. De hecho, utilizando una de estas líneas, se demostró por primera vez que H2O2 producido en el contexto de una herida no sólo funciona como un compuesto antiséptico, sino que también forma un gradiente necesario para la rápida atracción de leucocitos [172]. Sin embargo, esta H2O2 el gradiente sólo se genera en las heridas y no se produce en los tejidos infectados [173]. La formación de este H2O2 Se demostró que el gradiente depende de la actividad oxidasa de Duox. La quinasa Lyn de la familia Src se ha identificado como el sensor redox que media la migración de neutrófilos hacia la herida [174]. La función inmune innata de Duox y la importancia de ROS en el pez cebra se establecieron aún más mediante estudios que muestran que la eliminación de Duox afectó la capacidad de las larvas de pez cebra para controlar la entérica. Salmonela infecciones [175]. También se ha demostrado que el pez cebra Phox es importante para controlar la en vivo crecimiento del hongo patógeno Candida albicans [176]. Se ha adoptado una técnica de trampa de inmunospina basada en 5,5-dimetil-l-pirrolina N-óxido (DMPO-) para la detección in situ de la producción de ROS en embriones de pez cebra [177]. DMPO es un sustrato químico que se une al oxígeno reactivo, que luego puede detectarse con un anticuerpo anti-DMPO. Este protocolo detecta la acumulación del producto conjugado, mostrando así una producción acumulada de ROS. Además, se ha desarrollado un ensayo de explosión respiratoria para embriones de pez cebra, que se utilizó para demostrar que los macrófagos y los neutrófilos son las células productoras de ROS en el pez cebra [178]. Un método similar está disponible para obtener imágenes de la producción de NO en embriones de pez cebra, utilizando una sonda de diaminofluoresceína que solo se vuelve fluorescente en presencia de NO [179]. Como se mencionó anteriormente, la nitración de residuos de tirosina es un sello distintivo de la producción de NO. Forlenza y col. (2008) utilizaron un anticuerpo antinitrotirosina en el tejido de la carpa común para visualizar la nitración del tejido que se produce en los sitios de Trypanoplasma borreli infección [21]. Usamos el mismo anticuerpo para inmunohistoquímica en embriones de pez cebra para visualizar la producción de RNS en respuesta a METRO. marinum infección (Figura 3). Esta técnica también visualiza el estrés nitrosativo que sufre el tejido huésped tras la liberación de RNS. La resolución de la inflamación que debería prevenir el daño tisular después de tales tensiones también se ha estudiado en el pez cebra. Esto ha llevado a nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a la resolución, incluida la apoptosis y la quimiotaxis retrógrada de los neutrófilos, con el factor de transcripción sensible al oxígeno factor 1 inducible por hipoxia.α (Hif-1α) desempeñando un papel en el control de estos mecanismos [171, 180].


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(C) En el lugar detección de especies reactivas de nitrógeno. Se inyectaron embriones de pez cebra de tipo salvaje (Albino 28 hpf) en la vena caudal con 200 unidades formadoras de colonias (UFC) de METRO. marinum Mma20 expresando un vector pMST3 :: mCherry. Se tomaron imágenes confocales de una región de la cola de la larva en desarrollo a los 3 días después de la infección (3 dpi), un punto en el que el METRO. marinum Se ha establecido la infección (a). Los embriones se fijaron en paraformaldehído al 4% a 3 dpi y se realizó inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo antinitrotirosina que detecta la nitración tisular (b) [21]. En este momento se puede observar la colocalización (c) entre las bacterias y la nitración extensa del tejido. Barra de escala: 10

4. Programas de expresión genética que reflejan respuestas inmunitarias innatas

4.1. Perfiles de expresión de todo el genoma

La disponibilidad de la secuencia del genoma del pez cebra facilita el uso de microarrays y técnicas de secuenciación profunda para el perfil de expresión de todo el genoma. Los embriones y larvas de pez cebra son útiles para en vivo análisis de los perfiles de expresión génica tras la infección, ya que se pueden agrupar grandes cantidades para nivelar la variación individual. Sin embargo, la combinación debe hacerse con precaución y es aconsejable verificar las conclusiones mediante análisis a nivel de embrión único [123]. Se ha desarrollado un protocolo para el aislamiento de ARN de un solo embrión que proporciona suficiente ARN para la secuenciación de microarrays o ARN [181]. El perfil de expresión se puede realizar a nivel de organismo completo o en células inmunes clasificadas por FACS de líneas transgénicas. Este último enfoque se utilizó para determinar la firma transcripcional de las células mieloides tempranas [87]. El análisis de microarrays de adultos de pez cebra y embriones infectados con varios patógenos ha proporcionado información sobre el transcriptoma durante la infección y ha proporcionado pistas para estudios funcionales adicionales (Tabla 1). La respuesta transcripcional tanto de los embriones de pez cebra como de los adultos mostró una clara conservación con las respuestas del huésped detectadas en otros modelos de vertebrados y células humanas. Los genes que se indujeron tras la infección incluyeron receptores implicados en el reconocimiento de patógenos, intermediarios de señalización, sus factores de transcripción descendentes (como NF B y AP-1) y mediadores inflamatorios. Además, estos estudios llevaron a la identificación de nuevos genes inmuno-sensibles y marcadores de infección, por ejemplo, el gen modulador de la autofagia 1 regulado por daños en el ADN (dram1), que se identificó en un estudio de eliminación de Traf6, un intermedio central en la señalización del receptor de TLR y TNF [37].

4.2. Comparación de perfiles de expresión génica inducidos por diferentes patógenos bacterianos

Para ilustrar las similitudes y diferencias en la respuesta inmune innata contra diferentes patógenos bacterianos, la Figura 4 muestra una comparación de los perfiles de expresión génica del pez cebra infectado con Edwardsiella tarda, S. tifimurio, y METRO. marinum. mi. tarda es un patógeno de peces gramnegativo de origen natural que pertenece a la familia de las enterobacterias. Dentro de su anfitrión, mi. tarda es capaz de resistir la actividad del complemento y puede sobrevivir dentro de los macrófagos [184]. Provoca una enfermedad progresiva cuando se inyecta en la vena caudal 28 horas después de la fertilización (hpf) de los embriones, lo que conduce a la mortalidad dentro de los 2 días posteriores a la infección (dpi) [123]. S. typhimurium (corto para S. enterica serovar Typhimurium), que también pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae Gram-negativas, causa salmonelosis en una amplia gama de huéspedes. S. tifimurio es una especie intracelular facultativa que puede sobrevivir dentro de células fagocíticas y no fagocíticas. Después de la internalización, sobrevive y se replica en un fagosoma modificado, conocido como Salmonela-que contiene vacuola. Igual que mi. tarda, inyección de S. tifimurio en la vena caudal a 28 hpf conduce a una enfermedad progresiva que conduce a la mortalidad del embrión durante las primeras 30 horas después de la infección (hpi) [13, 185]. A diferencia de, METRO. marinum La inyección en la misma etapa conduce a una infección crónica que persiste durante el desarrollo larvario. METRO. marinum es un patógeno natural de los peces teleósteos y un pariente cercano de METRO. tuberculosis, el agente causante de la tuberculosis en humanos. Micobacterias tienen una pared celular espesa, cerosa y resistente a los ácidos que contiene lípidos característicos que son importantes para la virulencia. Ambos METRO. marinum y METRO. tuberculosis tienen la capacidad de replicarse dentro de los macrófagos, lo que eventualmente hace que sufran apoptosis. Depende de factores de virulencia secretados que se conservan entre METRO. marinum y METRO. tuberculosis, otros macrófagos se sienten atraídos por el sitio de infección inicial. Estos se infectan fagocitando los restos apoptóticos, lo que finalmente conduce a la formación de un granuloma [186]. Utilizando el modelo de embrión de pez cebra, Ramakrishan et al. han proporcionado nuevos conocimientos que demuestran la importancia del sistema inmunológico innato para controlar METRO. marinum Infección durante las primeras etapas de la patogenia [1, 2, 124, 187, 188].


Comparación de la respuesta inmune innata del pez cebra a diferentes patógenos bacterianos. Perfiles de expresión génica de embriones de pez cebra y adultos infectados con mi. tarda FL6-60 (Et), S. typhimuriumSL1027 (St), y METRO. marinum Mma20 (Mm) se representan en un mapa de calor. Los embriones se infectaron con 200 UFC de cada patógeno en la vena caudal a 28 hpf y se congelaron instantáneamente individualmente a 8 hpi para E. tarda y S. tifimurioy a 8 hpi y 4 ppp para METRO. marinum. Se compararon muestras por triplicado para cada condición de infección con muestras de embriones de control (inyectados con PBS) utilizando un diseño de micromatriz de referencia común. Los datos brutos se depositaron en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE35474. Los datos derivados de infecciones embrionarias se compararon con los datos de un estudio en el que peces cebra adultos se infectaron intraperitonealmente con METRO. marinum Mma20, después de lo cual se tomaron muestras de ARN a 1 dpi y 6 dpi [22]. La dosis del Mma20 La cepa utilizada en el estudio de infección de adultos fue letal días después del punto de muestreo final a 6 dpi. En el mapa de calor solo se incluyeron genes relevantes para este artículo. Todos los genes seleccionados están representados por un mínimo de dos sondas que mostraron una regulación significativa hacia arriba o hacia abajo (los puntos de corte de importancia para las proporciones de grupos infectados frente a grupos de control se establecieron en 2 veces con

Como complemento a los datos del transcriptoma informados anteriormente (Tabla 1), aquí presentamos nuevos datos que comparan los perfiles de expresión génica inducidos por mi. tarda, S. typhimurium, y METRO. marinum en condiciones similares (Figura 4). Inyectamos 200 unidades formadoras de colonias (UFC) de cada patógeno en la vena caudal de 28 embriones de pez cebra hpf y analizamos la respuesta a 8 hpi. Ya que METRO. marinum desarrolla una infección crónica, también tomamos muestras a 4 dpi, un momento en el que están presentes los granulomas. Finalmente, comparamos el perfil del transcriptoma de las muestras embrionarias con datos de un estudio anterior, en el que peces cebra adultos fueron infectados con la misma cepa de METRO. marinum [22].

Los dos patógenos gramnegativos progresivos, mi. tarda y S. tifimurio, indujo una fuerte respuesta inmune temprana a las 8 hpi, mientras que la METRO. marinum la infección apenas indujo respuesta alguna en este momento. A 4 dpi, el perfil del transcriptoma de METRO. marinumLos embriones infectados mostraron una respuesta inmune, aunque todavía era más débil que la respuesta a mi. tarda o S. tifimurio infección a las 8 hpi. En los adultos, la respuesta inmune a METRO. marinum Se ha demostrado que la infección se desarrolla de manera similar, sin apenas inducción de genes proinflamatorios a 1 dpi y una respuesta más fuerte a 6 dpi, cuando los peces comenzaron a mostrar síntomas de enfermedad [22]. Infecciones con mi. tarda y S. tifimurio resultó en un transcriptoma notablemente similar. Sin embargo, se observaron diferencias sutiles, como la regulación positiva de Tlr3 que era específica de mi. tarda infección en este conjunto de datos, y la variación en el panel de citoquinas expresadas sobre estas infecciones.

Curiosamente, varios PRR, por ejemplo, Tlr5a y 5b, mostraron una expresión aumentada tras la infección, lo que probablemente indica un estado elevado de conciencia necesario para identificar los patógenos invasores. Por el contrario, el Tlr18 específico de peces, los receptores de barrido CD36, scarb1 y scarb2, y la lectina de tipo C Mbl se regularon negativamente en algunas condiciones. En muchos casos, los intermediarios de señalización aguas abajo de los PRR se regularon positivamente, transmitiendo y posiblemente amplificando las señales de activación que reciben de sus respectivos receptores.Una amplia gama de factores de transcripción con funciones bien establecidas en la inmunidad (por ejemplo, Atf3, Jun y Fos, Rel y los miembros de la familia IRF y Stat) se regularon significativamente al alza en todas las condiciones probadas, excepto en el punto de tiempo de 8 hpi de METRO. marinum infección, mientras que observamos una regulación positiva de los factores de transcripción de la familia oncogénica Myc principalmente en peces adultos. El factor de transcripción hematopoyético Spi1 (Pu.1) se incrementó en METRO. marinum Infección de embriones y adultos. Genes para las citocinas proinflamatorias clave, como el TNFα (dos genes en el pez cebra: tnfa y tnfb), IL1β, e IL8, y para la citocina antiinflamatoria IL10 fueron inducidas por infección con cualquiera de los tres patógenos. Otras citocinas parecían ser más específicas para ciertos patógenos o podrían no expresarse en el momento específico de la infección que muestreamos.

También observamos una mayor expresión de genes implicados en los mecanismos efectores. Sin embargo, la regulación al alza de los genes que codifican lisozima, mieloperoxidasa e iNos fue detectable solo en peces cebra adultos infectados con METRO. marinum. La infección con cualquiera de los tres patógenos condujo a un aumento de la expresión génica de ncf1, una subunidad del complejo neutrófilo NADPH oxidasa. Las proteasas son una parte importante de la respuesta inmune innata, funcionando en la reorganización de la matriz extracelular para permitir la migración de leucocitos, en la degradación de microbios y en el procesamiento de citocinas. En pez cebra adulto infectado con METRO. marinum, observamos una regulación al alza de 1a y 1b similares a la catepsina (ctsl1a y ctsl1b), miembros de la familia de las catepsinas lisosomales que ayudan en la destrucción de microbios. Niveles de expresión de casp6 y caspb, los miembros de la familia de la cisteína-proteasa del ácido aspártico (caspasa) implicados en la apoptosis, se regularon negativamente en diferentes etapas de la infección en adultos y embriones. Los genes de la metaloproteinasa de matriz (mmp) 9 y mmp13 demostraron ser excelentes marcadores de infección, ya que su expresión génica fue inducida por mi. tarda, S. tifimurio y METRO. marinum.

Nuestros datos sugieren además que la activación del complemento juega un papel importante durante la respuesta inmune innata temprana, ya que un gran número de genes del factor del complemento muestran una mayor expresión tras la infección. Expresión regulada al alza de los genes marcadores de autofagia lc3 y gabarap en adultos infectados con METRO. marinum insinúa un papel de la autofagia en el control de esta infección. Curiosamente, un gen expresado en macrófagos con función desconocida en la inmunidad, mpeg1 [87], se regula a la baja durante la respuesta inmune embrionaria contra los tres patógenos. El homólogo de ratón de este gen codifica una proteína similar a la perforina que se expresa en macrófagos maduros y células cerebrales infectadas con priones [189]. También hemos observado una regulación positiva específica de genes con una función aún desconocida en la inmunidad, como el gen inmunorrespondedor 1 (irg1). Este gen está muy conservado en vertebrados y tiene una alta homología con la metilcitrato deshidrogenasa bacteriana [190]. También incluimos algunos genes involucrados en la inmunidad adaptativa en nuestra comparación, el marcador de linfocitos rag1, el gen de la cadena pesada de inmunoglobulina ighm, y el gen UEA de clase I del complejo principal de histocompatibilidad presentador de antígeno (mhc1uea). Aunque todavía no hay células del sistema inmunológico adaptativo, los embriones infectados con mi. tarda o S. tifimurio aumentar la expresión del gen MHC I. Finalmente, tras la infección con S. tifimurio y METRO. marimum, observamos una regulación ascendente y descendente de las quitinasas, una familia de genes a la que se le ha atribuido un papel durante las interacciones huésped-microbiano implicadas en el desarrollo de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas [191].

5. Discusión

Los modelos de enfermedades infecciosas del pez cebra han comenzado a hacer una contribución importante a la comprensión de los mecanismos de interacción huésped-patógeno. Un buen ejemplo es el descubrimiento del mecanismo por el cual un factor de virulencia micobacteriana (ESAT6) induce mmp9 expresión en las células epiteliales del huésped vecinas a los macrófagos infectados, lo que mejora el reclutamiento de macrófagos y la formación de agregados similares a granulomas que proporcionan un nicho de replicación para las micobacterias [2]. La combinación de genética y en vivo la obtención de imágenes en embriones de pez cebra no tiene paralelo en otros modelos de vertebrados. Además, los embriones de pez cebra proporcionan un modelo ideal para un alto rendimiento en vivo cribado de candidatos a fármacos antimicrobianos o candidatos a nuevas vacunas [192, 193]. El conocimiento del sistema inmunológico del pez cebra también es importante en la detección de cáncer de alto rendimiento en embriones de pez cebra [194]. Sin embargo, muchos aspectos de la inmunidad del pez cebra aún requieren una mayor caracterización y validación.

Las líneas transgénicas actualmente disponibles distinguen claramente los macrófagos (marcados por csf1r/fms y mpeg1) de neutrófilos (marcados por mpx y Lyz) en embriones y larvas, pero no hay suficiente conocimiento de los marcadores de superficie para identificar diferentes subpoblaciones de macrófagos y neutrófilos. Al igual que en los mamíferos, existe evidencia de la existencia de subpoblaciones de macrófagos activados clásicamente (M1: altos productores de mediadores proinflamatorios, ROS y NO) y macrófagos activados alternativamente (M2: altos productores de mediadores antiinflamatorios) en peces [195] . La polarización de los macrófagos hacia estos subtipos desempeña un papel fundamental en la patología tanto de las enfermedades infecciosas como del cáncer [196]. Además, recientemente se han descrito diferentes subpoblaciones de neutrófilos de mamíferos (N1 y N2) que exhiben propiedades pro y antitumorales [197] y que probablemente también tendrán funciones distintivas durante la patología de enfermedades infecciosas. Se demostró que los implantes de tumores en embriones de pez cebra atraen una población heterogénea de leucocitos, incluidas células que expresan arginasa, un marcador de macrófagos activados alternativamente [177]. Además, los marcadores de neutrófilos mpx, mych, y Lyz no muestran una superposición completa [177, 198] y marcadores como cxcr3.2 y ptpn6, que son específicos de macrófagos en embriones de un día, también marcan un subconjunto de neutrófilos en etapas posteriores [87]. El desarrollo futuro de líneas transgénicas que puedan distinguir estos múltiples subconjuntos mieloides fortalecería aún más el uso de modelos de pez cebra para estudios de inmunidad innata y enfermedades infecciosas.

Como se detalla en este documento, las contrapartes de los principales PRR de vertebrados y los componentes de señalización aguas abajo se han identificado en el pez cebra, pero hasta ahora se han estudiado funcionalmente relativamente pocos en modelos de enfermedades infecciosas. Recientemente, se han descrito nuevos PRR en mamíferos, como la proteína quinasa R (PKR) activada por dsRNA inducible por INF [199], el sensor de ADN citosólico dependiente del ADN activador de factores reguladores de IFN (DAI) [200], y un receptor de ADN citosólico denominado AIM2 (ausente en el melanoma 2) [201]. Hasta ahora, solo se ha identificado el homólogo de pez cebra para PKR. Además, los adaptadores autofágicos conocidos como receptores de tipo secuestosoma 1 / p62 (SLR), conservados entre el pez cebra y el ser humano, se han sugerido recientemente como una nueva categoría de PRR, ya que tienen la capacidad de reconocer y capturar objetivos para la autofagia relacionada con el sistema inmunológico [ 202].

Varios conjuntos de datos derivados de análisis de transcriptomas han demostrado la especificidad de las respuestas inmunes a diferentes patógenos. En estudios futuros, el análisis de estas respuestas puede refinarse mediante la clasificación FACS de poblaciones de células inmunitarias de embriones infectados, utilizando patógenos marcados en combinación con líneas transgénicas para diferentes tipos de células inmunitarias. Por ejemplo, ahora está al alcance el objetivo de analizar las diferencias en la expresión génica entre METRO. marinummacrófagos infectados dentro de un granuloma y recientemente atrajeron macrófagos no infectados. Además, la elaboración de perfiles simultáneos de los genes del patógeno y del hospedador será un enfoque desafiante para ayudar a desentrañar los complejos mecanismos que subyacen a las interacciones entre el hospedador y el patógeno. El análisis del transcriptoma solo revela niveles de ARN alterados tras la infección y, por lo tanto, se necesita la aplicación de análisis proteómicos y epigenéticos para estudiar la regulación de las respuestas inmunitarias en diferentes niveles. Los estudios de transcriptomas han revelado la capacidad de respuesta a infecciones de muchos genes que aún no han sido bien estudiados (por ejemplo, dram1, mpeg1, irg1, y irg1l, mencionado anteriormente) y una función inmune emergente para varias proteínas similares a la quitinasa durante la infección [13, 37, 123]. Muchos modelos de infección por pez cebra se han descrito aquí y en otros artículos recientes [4, 203, 204] que pueden usarse para investigar las funciones de estos genes en diferentes interacciones patógenas, ya sea usando la eliminación de morfolinos en embriones o usando líneas de eliminación estables que hoy en día pueden identificarse de manera muy eficiente mediante la resecuenciación de alto rendimiento de bibliotecas mutantes o mediante enfoques de eliminación selectiva que utilizan tecnologías como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) o las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) [205].

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a Dan Klionsky (Universidad de Michigan) por la línea de pez cebra GFP-Lc3, Maria Forlenza (Universidad de Wageningen) por el anticuerpo antinitrotirosina y Phil Elks por leer críticamente el artículo. La investigación de enfermedades infecciosas en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo del Programa Smart Mix del Ministerio de Asuntos Económicos de los Países Bajos y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia, el séptimo proyecto marco de la Comisión Europea ZF-HEALTH (HEALTH-F4-2010-242048), y la Red europea de formación inicial Marie-Curie FishForPharma (PITN-GA-2011-289209).

Referencias

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