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Propiedad topológica del ADN


Estaba leyendo un curso sobre ADN superenrollado y me detuve en esta definición:

[…] En el caso del ADN, una propiedad topológica es aquella que no se ve afectada por la torsión y el giro del eje del ADN y solo puede cambiarse por la rotura y la unión de la columna vertebral del ADN. (Fuente)

No entendí lo que significan, ¿alguien puede aclararlo por favor?


El superenrollamiento del ADN se puede describir numéricamente mediante cambios en el número de enlace $ L_k $, es la propiedad más descriptiva del ADN superenrollado.

El número de enlace $ L_k $ es equivalente a la suma de $ Tw $, que es el número de giros o vueltas de la doble hélice, y $ Wr $ que es el número de espiras o se retuerce.

$$ L_k = Tw + Wr $$

[… ] Si hay una molécula de ADN cerrada, la suma de $ Tw $ y $ Wr $, o el número de enlace, no cambia. […] Dado que el número de enlace L del ADN superenrollado es el número de veces que las dos hebras se entrelazan (y ambas hebras permanecen covalentemente intactas), L no puede cambiar.

No se como explicarlo mas pero creo la idea principal está representada en la imagen de abajo.

Editar:

De la topología del ADN: fundamentos:

Hay dos características importantes de $ L_k $:

  1. $ L_k $ es siempre un entero.
  2. $ L_k $ no se puede cambiar por ninguna deformación de las hebras de ADN, es decir, es topológicamente invariante. La única forma de cambiarlo es introducir una ruptura en una o ambas hebras de ADN, rotar las dos hebras de ADN entre sí y sellar la ruptura. Este es precisamente el papel de las ADN topoisomerasas.

Pregunta relacionada: Razón detrás de la formación de superenrollamientos positivos durante la replicación / transcripción del ADN.

Fuentes: superenrollamiento de ADN y topología de ADN.


Estructuras topológicas en biología computacional

Los fenómenos que rodean y surgen de las características topológicas de los ácidos nucleicos y la geometría métrica de las proteínas forman la base de muchas cuestiones fundamentales en biología molecular. Las herramientas de la topología de baja dimensión y la teoría de los nudos han sido muy visibles al proporcionar descripciones de los fenómenos asociados con el superenrollamiento, el anudado y la catenación en las cadenas de ADN y ARN. Muchos otros desafíos en biología exigen las herramientas cualitativas que proporciona la topología. Las preguntas sobre la determinación de la estructura de las proteínas y la biología estructural requieren descifrar la conexión entre las propiedades geométricas locales y las características topológicas globales, como los patrones de plegado. Además, ha habido un trabajo fascinante reciente para comprender el impacto biológico más amplio y las consecuencias de las características topológicas de las macromoléculas. En un nivel superior de abstracción, hay un cuerpo de trabajo en desarrollo sobre la aplicación de ideas topológicas al estudio de las propiedades de las redes de regulación de genes y los gráficos de interacción de proteínas, muchos de los cuales implican métodos topológicos. Las matemáticas de los datos genómicos se encuentran en un intenso desarrollo que se beneficiaría de herramientas cualitativas y sólidas.

Aunque ha habido una rápida asimilación de ciertas ideas topológicas en la comunidad biológica (por ejemplo, el trabajo de vincular números y retorcerse en hebras de ADN), un aumento en la amplitud y profundidad de esta interacción requiere una mezcla de comunidades de investigación que este taller proporcionará. .


Material basado en ADN con propiedades ajustables

A la izquierda, una instantánea del sistema simulado: una solución densa de plásmido superenrollado. A la derecha, una vista más detallada del fluido superenrollado que muestra entrelazamientos entre las moléculas.

Newswise & # 8212 Si bien el ADN a menudo se idealiza como la "molécula de la vida", también es un polímero altamente sofisticado que se puede utilizar para materiales de próxima generación. Más allá del hecho de que puede almacenar información, otros aspectos fascinantes del ADN son sus propiedades geométricas y topológicas, como el anudado y el superenrollamiento. De hecho, al igual que un cable telefónico retorcido, el ADN a menudo se encuentra enrollado dentro de bacterias y otras células e incluso anudado en virus. Ahora, una colaboración de científicos de las universidades de Edimburgo, San Diego y Viena ha comenzado a aprovechar estas propiedades para crear fluidos complejos basados ​​en ADN y materiales blandos "topológicamente ajustables" con aplicaciones potenciales en la administración de fármacos y la regeneración de tejidos, como se publicó en Science Advances. .

La conocida forma de doble hélice del ADN tiene profundas implicaciones en su comportamiento. Una molécula de ADN lineal, es decir, una molécula de ADN con dos extremos, puede girar y girar libremente. Por el contrario, unir los dos extremos para formar un círculo de ADN implica que cualquier torsión por encima o por debajo de la doble hélice permanece "bloqueada topológicamente", es decir, la torsión adicional no se puede eliminar sin cortar la molécula. Los giros excesivos o insuficientes tienen consecuencias interesantes sobre cómo las moléculas de ADN se organizan en el espacio y, en particular, se enrollan y abrochan sobre sí mismas como un viejo cable telefónico en las denominadas conformaciones superenrolladas (Fig. 1). El pandeo del ADN alivia el estrés de la torsión excesiva / insuficiente y, por lo tanto, disminuye el tamaño total de la molécula. Por esta razón, se cree que el superenrollamiento es un mecanismo natural empleado por las células para empaquetar su genoma en espacios diminutos. Mientras que el tamaño más pequeño conduce naturalmente a una difusión más rápida de las moléculas de ADN en solución, p. en agua oa través de los poros del gel, debido al menor arrastre, este comportamiento bien entendido no ocurre cuando muchas moléculas de ADN están empaquetadas y enredadas como espaguetis en un cuenco.

"Hemos realizado simulaciones por ordenador a gran escala de soluciones densas de moléculas de ADN con diferente grado de superenrollamiento y hemos encontrado varios resultados sorprendentes", explica Jan Smrek de la Universidad de Viena, primer autor del estudio. "En contraste con el caso diluido, cuanto más superenrollados están los anillos de ADN, mayor es su tamaño". Dado que las moléculas deben evitarse entre sí, sus formas adoptan conformaciones fuertemente asimétricas y ramificadas que ocupan más volumen que sus contrapartes no superenrolladas. Curiosamente, y contrariamente a las expectativas, "las moléculas de ADN más grandes aún producen una difusión más rápida". La difusión más rápida significa que la solución tiene menor viscosidad.

Las moléculas de ADN superenrollado que se encuentran de forma natural en las bacterias se conocen como plásmidos. In vivo, las células tienen proteínas especiales llamadas topoisomerasa que pueden reducir la cantidad de superenrollamiento en los plásmidos. "Gracias a estas proteínas y mdash que se pueden purificar y utilizar en el laboratorio, podemos controlar el grado de superenrollamiento en plásmidos de ADN entrelazados y estudiar su dinámica utilizando tintes fluorescentes. Nos sorprendió descubrir que, de hecho, los plásmidos de ADN que eran tratados con topoisomerasa, y por lo tanto con bajo superenrollamiento, son más lentos que sus contrapartes altamente superenrollados ". explica Rae Robertson Anderson, quien dirigió los experimentos en la Universidad de San Diego.

Para explicar la sorprendente dinámica más rápida, los científicos utilizaron simulaciones a gran escala en supercomputadoras para cuantificar qué tan entrelazadas están las moléculas en las soluciones. Si bien se sabe que un polímero en forma de anillo & mdash bastante similar a un plásmido de ADN circular & mdash puede ser enhebrado por otro anillo, lo que significa que este último puede atravesar el ojo del primero, no se sabía cómo este tipo de entrelazamiento impacta el movimiento de ADN superenrollado. Gracias a las simulaciones, los científicos descubrieron que un alto grado de superenrollamiento disminuye el área penetrable de cada molécula, lo que a su vez genera menos hebras entre los plásmidos y, en última instancia, produce una solución con menor viscosidad. Sin embargo, los plásmidos aún podrían envolverse entre sí y restringir el movimiento de los demás sin enhebrar. Sin embargo, el superenrollamiento refuerza las conformaciones y, por lo tanto, las hace menos propensas a doblarse y entrelazarse con fuerza, lo que también reduce este tipo de enredo.

Davide Michieletto de la Universidad de Edimburgo concluye, "no solo encontramos estos efectos novedosos en simulaciones, sino que también demostramos estas tendencias experimentalmente y desarrollamos una teoría que las describe cuantitativamente. Al cambiar el superenrollamiento podemos ajustar la viscosidad de estos fluidos complejos en Will. Ahora entendemos mucho mejor la conexión entre la geometría adaptativa de las moléculas y las propiedades del material resultante. Esto no solo es emocionante desde la perspectiva fundamental, sino que también promete aplicaciones útiles. Usando enzimas dedicadas, como la topoisomerasa, uno puede diseñar materiales blandos intercambiables basados ​​en ADN con propiedades ajustables ".


MATERIALES Y MÉTODOS

Estudiamos sistemas compuestos por METRO (de 2 a 20) polígonos equiláteros libremente articulados, cada uno con norte (de 4 a 20) segmentos de longitud l confinado dentro de una esfera de radio 2 l . Cada segmento es un cilindro de núcleo duro con radio 10-5 l (es decir, la distancia entre dos segmentos no consecutivos debe ser superior a 2 × 10 –5 l ). Este diámetro efectivo muy bajo prácticamente eliminó las interacciones de volumen excluidas entre los segmentos y fue requerido computacionalmente para controlar la topología de los polígonos simulados. El sistema modelado puede parecer demasiado pequeño para reflejar el empaquetamiento de cromatina en los núcleos eucariotas. Sin embargo, con la configuración en la que modelamos 20 polígonos equiláteros articulados libremente, cada uno compuesto por 20 segmentos y empaquetado dentro de la esfera que tiene el diámetro de cuatro segmentos, nos acercamos de cerca a la situación dentro de los núcleos de levadura. Las estimaciones de la longitud del segmento estadístico de las fibras de cromatina oscilan entre 130 y 270 nm, mientras que las estimaciones de densidad de nucleosomas oscilan entre 3,6 y 6 por 11 nm (25). Por lo tanto, asumiendo que la longitud del segmento estadístico de la cromatina es 250 nm, cada segmento estadístico contendría ~ 115 nucleosomas, lo que se traduciría en aproximadamente 23 000 pb. Como consecuencia, cada polígono compuesto por 20 segmentos estadísticos corresponde a 460 000 bp (que es un buen tamaño para un cromosoma de levadura, ya que estos varían de 200 a 2200 kb), mientras que las 20 cadenas modeladas corresponden a 9 200 000 bp empaquetados dentro de una esfera. con un diámetro de aproximadamente 1 µm. Así, nuestros sistemas de simulación se acercan a la situación en núcleos de levadura que tienen un diámetro de aproximadamente 1,5 µm y contienen 24 000 000 pb (por genoma diploide). De hecho, la densidad de la cromatina modelada en nuestro sistema excede ligeramente esta en los núcleos de levadura.

Para muestrear el espacio de configuración usamos el algoritmo de Monte-Carlo descrito en (26, 27). Solo usamos movimientos de rotación del cigüeñal, donde las subcadenas elegidas al azar giran a lo largo de la línea que conecta el primer y último vértice de la subcadena. En el caso de las cadenas fantasma, el ángulo de rotación se eligió al azar entre - π y π con distribución uniforme. En el caso de las cadenas no fantasma, primero determinamos el rango de ángulos de rotación de manera que la subcadena no cruzara ningún otro segmento durante la rotación. A continuación, se eligió aleatoriamente el ángulo de rotación en este rango con distribución uniforme. Para las cadenas fantasma y no fantasma, no aceptamos nuevas configuraciones resultantes de rotaciones del cigüeñal que resultaron en colocar cualquier vértice de la cadena fuera de la esfera de confinamiento. Para cada ejecución de simulación con un número determinado de polígonos METRO y una longitud de cadena determinada norte , hemos desarrollado el sistema en 2 × 10 9 rotaciones del cigüeñal. Las primeras configuraciones de 1 × 10 6 no se ingresaron en las estadísticas.

Para generar configuraciones iniciales, comenzamos con cada polígono en una configuración N-gon regular, apilados uno encima del otro. Agregamos una energía dada por la suma de la distancia al cuadrado de todos los vértices al centro de la esfera. El algoritmo Monte-Carlo Metropolis con cadenas no fantasma descrito anteriormente se usó luego con una temperatura que disminuía lentamente hasta que todos los polígonos estaban dentro de la esfera (ver Figura S1A). Tenga en cuenta que las configuraciones iniciales obtenidas con este procedimiento no están anudadas ni encadenadas.

Hemos verificado que el estado de equilibrio alcanzado era independiente de las condiciones iniciales mediante la realización de varias ejecuciones de simulación en las que las configuraciones iniciales se construyeron a partir de polígonos individuales altamente compactados bien separados entre sí (Figura S1B).

Es importante agregar aquí que las simulaciones de Monte-Carlo como las que usamos no son adecuadas para seguir la evolución o la cinética del sistema investigado. Sin embargo, después de un tiempo de equilibrio suficiente, las configuraciones generadas muestrean de una manera muy eficiente y no sesgada el espacio de configuración accesible al sistema físico modelado, como moléculas de ADN o fibras de cromatina (26, 28, 29). Además este tipo de simulaciones permiten una caracterización del equilibrio mucho mejor que los enfoques de simulación que permiten seguir la evolución del sistema y así dar información sobre la cinética.


Introducción

El modelo de replicón fue el primer intento de explicar cómo se regula la replicación del ADN en las bacterias (Jacob et al, 1963). Originalmente formulado sobre la base de las observaciones realizadas en Escherichia coli, luego se extendió a plásmidos, fagos y cromosomas de todos los procariotas y eucariotas. Cuarenta años después, los aspectos clave del modelo de replicón siguen siendo válidos y durante este tiempo ha inspirado numerosos descubrimientos importantes (Jacob, 1993 Nordstrom, 2003). Brevemente, el modelo desarrolló el tema de las unidades de replicación, que los autores denominaron replicones. Se afirmó que la regulación de la replicación del ADN implicaba al menos dos elementos: una proteína específica, el iniciador, y una secuencia de ADN diana, el replicador, hoy en día conocido como el "origen de la replicación". Solo un par de años después de que François Jacob, Sydney Brenner y François Cuzin lanzaran el modelo de replicón en una reunión en Cold Spring Harbour (Jacob et al, 1963), Gerome Vinograd y colaboradores encontraron que el genoma circular del virus del polioma está superenrollado (Vinograd et al, 1965). Esta observación se extendió más tarde a prácticamente todo el ADN dúplex circular (Cozzarelli, 1980). El superenrollamiento, que literalmente significa enrollamiento de una bobina, es una propiedad topológica de las moléculas de ADN en la que la doble hélice gira alrededor de su propio eje en un espacio tridimensional (Bowater, 2002). El hallazgo de que el ADN está superenrollado, junto con el descubrimiento de las topoisomerasas (Wang, 1971) abrió un campo completamente nuevo en la biología molecular: la topología del ADN (Wang, 2002).

El objetivo principal de esta revisión es resumir lo que se sabe sobre los cambios topológicos que tienen lugar a medida que se replica un replicón. Nos centramos en pequeños plásmidos bacterianos, ya que la mayoría de los estudios que han abordado este problema han utilizado pBR322 y otros pequeños derivados como sistema modelo. Sin embargo, cabe señalar que no siempre es posible extrapolar las observaciones realizadas en pequeños plásmidos a cromosomas bacterianos o eucariotas. Los plásmidos son pequeños dominios topológicos que no reflejan necesariamente las condiciones de los grandes dominios de los cromosomas de procariotas y eucariotas (Higgins y Vologodskii, 2004).

Introducción a la topología del ADN y las topoisomerasas del ADN

Se dice que una molécula de ADN está superenrollada negativamente (-) cuando el número de enlace (el número mínimo de pasajes necesarios de una hebra a través de otra para separarlas) es menor que en el ADN circular relajado del tamaño correspondiente. Ambos en vivo (Bliska y Cozzarelli, 1987) y in vitro (Bednar et al, 1994), se sabe que (-) los plásmidos bacterianos superenrollados adoptan una configuración entrelazada a la derecha en la que los cruces dúplex-dúplex tienen un signo (-) (ver Fig. 1A, B para una explicación). En las células eucariotas, el superenrollamiento (-) está restringido por el devanado izquierdo del ADN alrededor de los nucleosomas, lo que da como resultado un devanado toroidal en el que los cruces dúplex-dúplex también tienen un signo (-) (Fig. 2B). Como se muestra en la Fig. 1A, la separación de la hebra local por una helicasa de ADN en moléculas de ADN superenrollado (-) conduce inicialmente a la relajación del superenrollamiento (-), mientras que una separación adicional provoca la acumulación de superenrollamiento positivo (+). La tensión de torsión que surge se opone a una mayor acción de la helicasa y se requieren topoisomerasas para una mayor separación de las cadenas de ADN.

Las topoisomerasas son enzimas que interconvierten diferentes estados topológicos del ADN. Se dividen en enzimas de tipo I y tipo II, que escinden transitoriamente una o ambas cadenas de ADN, respectivamente. Las topoisomerasas de tipo I se dividen adicionalmente en dos subtipos: A y B. Las enzimas que pertenecen al subtipo A tienen un mecanismo de acción complejo que implica el paso de la hebra sin cortar a través de la escisión por puente enzimático de la otra hebra. Curiosamente, mientras actúan sobre el ADN con muescas o con regiones monocatenarias, las topoisomerasas de tipo IA pueden escindir la hebra continua y permitir el paso de un segmento de ADN dúplex de la misma u otra molécula de ADN a través de la hebra cortada. Las topoisomerasas del subtipo IB actúan mediante un mecanismo más simple que implica la rotación libre del ADN en el sitio de la mella transitoria (Stasiak, 2003). Hay dos topoisomerasas de tipo I en E. coli que se conocen como topo I y III y ambos pertenecen al subtipo A (Champoux, 2001). En tono rimbombante, E. coli topo I y III apenas son activos en la mayor parte del ADN celular que se mantiene a niveles fisiológicos de (-) superenrollamiento. El superenrollamiento no fisiológicamente fuerte (-) o la presencia de regiones monocatenarias activan el topo I y III (Champoux, 2001). Las topoisomerasas de tipo II hacen rupturas transitorias de doble hebra y permiten el paso de otro dúplex a través de la ruptura. Suelen depender de ATP (Gellert et al, 1976). Hay dos topoisomerasas de tipo II en E. coli, que se conocen como ADN girasa y topo IV (Champoux, 2001). Al igual que con E. coli Las topoisomerasas de tipo I, girasa y topo IV también son escasamente activas en la mayor parte del ADN celular y se activan por relajación del ADN en el caso de girasa y por (+) superenrollamiento en el caso de topo IV. Es importante para el equilibrio energético que no haya una acción inútil de las topoisomerasas en la mayor parte del ADN a través de la cual una girasa, por ejemplo, usaría continuamente ATP para introducir (-) superenrollamiento y la topo I o III relajaría el ADN. Por lo tanto, la acción de la topoisomerasa debe limitarse a los procesos biológicos que involucran al ADN, como la replicación, la transcripción, la recombinación y la reparación, durante los cuales se debe modificar la topología del ADN.

Tira y afloja entre (-) y (+) superenrollamiento

Para iniciar su replicación, los plásmidos bacterianos deben estar (-) superenrollados, ya que esto facilita la separación de las hebras en el origen de la replicación (Fig. 1A Funnell et al, 1987 Marianos et al, 1986). Una vez que se ha logrado la iniciación, el alargamiento procede por medio de un conjunto complejo de enzimas conocido como replisoma. La opinión actual es que durante la replicación, el ADN pasa a través de un replisoma estacionario. Delante de este replisoma, una helicasa de ADN hexamérica separa las hebras parentales que se utilizarán como plantillas. Esta separación de hebras conduce a un sobreenrollamiento (superenrollamiento positivo) del dúplex delante de la bifurcación (Fig.1A Alexandrov et al, 1999 Peter et al, 1998 Ullsperger et al, 1995). Sin embargo, el superenrollamiento (-) es importante para la apertura de la doble hélice del ADN (Crisona et al, 2000 Kanaar y Cozzarelli, 1992). Entonces, ¿cómo logran los intermedios de replicación (RI) permanecer (-) superenrollados a medida que avanza la bifurcación? La primera pista para responder a esta pregunta vino con el descubrimiento de la ADN girasa (Gellert et al, 1976). Se cree que la acción continua de la girasa sobre la porción no replicada de los plásmidos replicantes disminuye el número de enlace del dúplex parental (Alexandrov et al, 1999 Peter et al, 1998 Ullsperger et al, 1995). De esta manera, gyrase ayuda a compensar el sobreenrollamiento del dúplex a medida que avanza la horquilla. Sin embargo, la velocidad de desvinculación por girasa es lenta y puede ser insuficiente para mantener la velocidad de movimiento de la horquilla en E. coli (Pedro et al, 1998). Además, la ADN girasa puede provocar activamente la desvinculación solo cuando actúa sobre la parte no replicada de los plásmidos en replicación (Gellert et al, 1976 Kampranis et al, 1999). En las primeras etapas de la replicación, cuando la porción que no se replica es lo suficientemente larga, varias moléculas de girasa podrían trabajar en paralelo para mantener una alta velocidad de desvinculación. Sin embargo, a medida que se reduce la longitud de la porción no replicada, hay menos espacio para que actúe la girasa. Cada molécula de girasa necesita alrededor de 150 pares de bases para unirse al ADN (Bates y Maxwell, 1989), por lo que el sobreenrollamiento causado por la bifurcación progresiva puede eventualmente acumularse. Este problema potencial fue reconocido por primera vez por James Champoux y Michael Been (Champoux & Been, 1980), quienes se dieron cuenta de que este déficit de girasa eventualmente conduciría a la acumulación de (+) superenrollamiento en etapas posteriores del proceso de replicación. Para resolver este dilema, propusieron que el superenrollamiento podría difundirse a lo largo de la bifurcación de replicación y redistribuirse tanto por delante como por detrás de la bifurcación. En este modelo, la otra topoisomerasa de tipo II, topo IV, que es la principal decatenasa en E. coli (Zechiedrich y Cozzarelli, 1995 Zechiedrich et al, 1997), ayuda a gyrase a compensar el exceso de enrollamiento que se acumula a medida que avanza la horquilla. Brian Peter y compañeros de trabajo (Peter et al, 1998) utilizó microscopía electrónica para confirmar la difusión de superenrollamiento a través de la horquilla en un in vitro ensayo que produjo plásmidos parcialmente replicados que contenían horquillas estancadas. Llamaron al entrelazamiento de los dúplex hermanos en la porción replicada "precatenanes" para distinguirlos del superenrollamiento en la porción no replicada (Figuras 2A y 3B, D, E). La idea emergente fue que la desvinculación del dúplex parental durante la replicación del ADN se lleva a cabo mediante la introducción de superenrollamientos (-) de girasa delante de la bifurcación y la eliminación de precatenanes topo IV detrás de la bifurcación. Esto explicaría por qué se impide la progresión de la horquilla de replicación cuando tanto la girasa como el topo IV están mutados o inhibidos (Hiasa et al, 1994 Khodursky et al, 2000 Levine et al, 1998). Es importante notar que para que el superenrollamiento se difunda a través de la bifurcación de replicación, los dúplex hermanos deben poder rotar libremente entre sí en las bifurcaciones. Curiosamente, para un RI superenrollado (-) in vitro, el dúplex parental se enrolla sobre sí mismo de manera diestra por delante de la bifurcación, mientras que detrás de la bifurcación los dúplex hermanos se enrollan de manera zurda (Postow et al, 2001a). Lo contrario ocurre en el caso de los RI superenrollados (+) (véanse las figuras 2A y 3B, D, E). Es bastante no intuitivo que la dirección del entrelazamiento de las regiones de doble hebra opuestas cambie entre las porciones replicadas y no replicadas de un RI que se encuentra bajo tensión de torsión. Sin embargo, es bien sabido que una transición elástica de formas toroidales a entrelazadas de superenrollamiento cambia la percepción de la mano del entrelazamiento mientras se mantiene el mismo signo topológico (Fig.2B Bauer et al, 1980). De manera similar, aunque la percepción de la mano del entrelazamiento dúplex-dúplex en las porciones replicadas y no replicadas de los RI superenrollados es diferente, el signo topológico de estos cruces en ambas partes sigue siendo el mismo (Fig. 2A).

Como se mencionó anteriormente, el superenrollamiento (-) ayuda a cualquier proceso que requiera la apertura de la doble hélice (Crisona et al, 2000 Kanaar y Cozzarelli, 1992). Además, recientemente se demostró que para las moléculas parcialmente replicadas que contienen horquillas estancadas, la introducción del superenrollamiento neto (+) in vitro conduce a la inversión de la horquilla de replicación a través de la formación de una unión ramificada de cuatro vías similar a Holliday, la llamada estructura de "pata de pollo" (Olavarrieta et al, 2002c Postow et al, 2001b Sogo et al, 2002 Viguera et al, 2000). En resumen, se piensa que la acción coordinada de girasa y topo IV permitiría que los IR permanezcan (-) superenrollados durante todo el proceso de replicación. Por lo tanto, en un momento dado durante la replicación, el grado de superenrollamiento sería el resultado del equilibrio entre la acción de al menos las tres enzimas diferentes ya mencionadas: ADN helicasa, que conduce a la acumulación de (+) superenrollamiento por delante del ADN de la horquilla. girasa, que introduce (-) superenrollamiento en la porción no replicada y topo IV, eliminando precatenanes detrás de la bifurcación (Peter et al, 1998 Postow et al, 1999, 2001a).

Electroforesis en gel de agarosa bidimensional (2D) de moléculas intactas formadas en vivo con la bifurcación parada a diferentes distancias del origen indicó que aquellos plásmidos con la bifurcación parada más cerca del origen están más superenrollados que aquellos con la bifurcación parada a distancias crecientes (Olavarrieta et al, 2002c). Esta observación sugiere que aunque los RI permanecen (-) superenrollados durante la replicación, se relajan progresivamente a medida que avanza la horquilla. Sin embargo, estos resultados deben examinarse con precaución, ya que no reflejan necesariamente la situación durante la replicación intacta del ADN. En aquellos plásmidos que contienen horquillas estancadas, puede haber un exceso de (-) estrés debido a la acción continua de la girasa una vez que la horquilla se ha detenido.

Burbujas anudadas como reporteros de la topología del ADN en vivo

Tan pronto como se descubrieron las ADN topoisomerasas, se comprendió que podían formarse nudos de ADN en las células vivas. Evidencia experimental de moléculas anudadas en vivo, sin embargo, era escasa (Liu et al, 1981 Shishido et al, 1989 Shishido et al, 1987). Por lo tanto, fue sorprendente cuando los estudios de plásmidos bacterianos con bifurcaciones estancadas revelaron que tales plásmidos podían anudarse. en vivo y que forman un arreglo característico de "cuentas en una cuerda" de bandas de ADN en geles 2D (Santamaría et al, 1998, 2000 Viguera et al, 1996). La estrategia utilizada para identificar estas burbujas anudadas implicó la escisión en la parte no replicada de los plásmidos y dio como resultado la identificación de nudos confinados dentro de las burbujas de replicación. La caracterización de la mano de estas burbujas de replicación anudadas por microscopía electrónica (Sogo et al, 1999) indicó que las moléculas parcialmente replicadas estaban (-) superenrolladas cuando ocurrió el anudado (Postow et al, 1999 ).

Los análisis de burbujas de replicación anudadas en moléculas parcialmente replicadas con la horquilla detenida a diferentes distancias del origen indicaron que el número y la complejidad de las burbujas de replicación anudadas aumenta a medida que avanza la horquilla (Olavarrieta et al, 2002b). Se podría argumentar que la probabilidad de que se formen nudos aumenta con el tamaño de la burbuja. Sin embargo, no es tan simple, ya que las burbujas del mismo tamaño muestran más nudos en pequeños plásmidos en los que el tenedor se detiene hacia el final de la replicación (Olavarrieta et al, 2002c) en comparación con plásmidos grandes en los que la horquilla se detiene al inicio del proceso (Olavarrieta et al, 2002b). En conjunto, estas observaciones sugieren que la probabilidad de que se anude detrás del tenedor está inversamente relacionada con la densidad del precatenano (Fig. 3B-E '). Para los precatenanos enrollados con regularidad, es poco probable que los pasajes dúplex-dúplex "atrapen" otro segmento de la misma molécula, mientras que este no es el caso de los precatenanos enrollados sueltos (Sogo et al, 1999 ).

Una vez que se completa la replicación, los precatenanos restantes y las burbujas de replicación anudadas se convierten automáticamente en catenanos (Figura 3F) que son eliminados por topo IV para permitir la segregación de los dúplex hermanos recién hechos (Lucas et al, 2001 Zechiedrich y Cozzarelli, 1995 Zechiedrich et al, 1997). Sin embargo, cabe señalar que para el E. coli cromosoma en vivo podría haber formas alternativas de descatenar dúplex hermanos (Ip et al, 2003). En cualquier caso, un aumento en el número y la complejidad de las burbujas de replicación anudadas aumentaría el número de nodos en el catenane (el número de veces que cada dúplex se enrolla alrededor de su hermana) y se esperaría que esto tuviera efectos perjudiciales en la segregación de recién nacidos. moléculas de ADN replicadas. Leticia Olavarrieta y colaboradores (Olavarrieta et al, 2002a) probó esta hipótesis comparando el número de burbujas de replicación anudadas en plásmidos en los que la transcripción de un gen seleccionado y la replicación ocurren en la misma dirección o en direcciones opuestas. Se espera que la progresión de la transcripción y la replicación en direcciones opuestas impulse la acumulación de superenrollamiento (+) entre las horquillas a medida que se acercan entre sí (Brewer, 1988 Wu et al, 1988). La migración de este superenrollamiento (+) detrás de la bifurcación relajaría el entrelazamiento regular de los dúplex hermanos y reduciría el número de precatenanes. El número y la complejidad de las burbujas de replicación anudadas es de hecho significativamente mayor cuando la transcripción y la replicación progresan entre sí (Olavarrieta et al, 2002a).

Un zoológico de productos intermedios de replicación

En resumen, la vista topológica actual del replicón se puede resumir de la siguiente manera: los plásmidos circulares necesitan ser (-) superenrollados para iniciar la replicación (Fig. 3A). Después de la iniciación, el superenrollamiento se distribuye entre las porciones replicadas y no replicadas (Fig. 3B). Los IR se relajan progresivamente a medida que avanza la bifurcación y hacia el final de la replicación, podrían perder todo el superenrollamiento nativo (-) (Fig. 3C). En etapas posteriores, podrían incluso adquirir superenrollamiento neto (+) (Fig. 3D) que, sin embargo, sería eliminado por la acción combinada de girasa y topo IV para restaurar el superenrollamiento (-) nativo (Fig 3E). Finalmente, una vez que se completa la replicación, todos los precatenanes restantes se convierten en catenanos (Fig. 3F) y su decantación por topo IV permite que los dos dúplex hermanos se segreguen libremente para completar el ciclo. La probabilidad de que se anude detrás del tenedor está inversamente relacionada con la densidad del precatenane. Por esta razón, se pueden formar burbujas anudadas, en particular hacia el final de la replicación (Fig. 3E ’). Los RI que tienen burbujas de replicación anudadas pueden estar (-) o (+) superenrollados. Estas burbujas anudadas podrían desanudarse por topo IV durante la replicación o convertirse en catenanos una vez que se complete la replicación. Alternativamente, la acumulación transitoria de superenrollamiento (+) podría conducir al estancamiento de la horquilla y la regresión a través de la formación de la estructura de "pata de pollo". Sin embargo, estos intermedios transitorios podrían rescatarse mediante la acción combinada de topo IV y ADN girasa para restaurar (-) el superenrollamiento y la regresión de horquilla inversa (Fig 3D ’).

La paradoja de la decantación de topo IV

Recientemente se descubrió que el topo IV relaja (+) superenrollamientos a una velocidad 20 veces más rápida que (-) superenrollamientos (Crisona et al, 2000). Es más, in vitro Los ensayos demostraron que el topo IV reconoce los cruces quirales impuestos por la superhélice izquierda de (+) ADN superenrollado (Charvin et al, 2003 Piedra et al, 2003 Trigueros et al, 2004). Esta observación desenmascaró una nueva paradoja. Como se indicó anteriormente (Figs.2A y 3B), para (-) RI superenrollados in vitro, el dúplex paterno se enrolla sobre sí mismo de manera diestra por delante de la bifurcación, mientras que detrás de la bifurcación los dúplex hermanos se enrollan de manera zurda. Si esta situación también se aplica en vivo, los precatenanos zurdos en (-) RI superenrollados serían reconocidos y eliminados por topo IV de manera preferencial. En tal caso, la acción del topo IV sería perjudicial, ya que eventualmente aumentaría el número de enlaces de las hebras parentales. Tenga en cuenta que gyrase estaría quemando ATP para bombear (-) superenrollamientos por delante de la bifurcación, mientras que el topo IV estaría quemando más ATP para eliminar estos mismos (-) superenrollamientos una vez que se difunden a través de la bifurcación y se convierten en precatenanos zurdos. Además, los precatenanos diestros presentes en (+) RI superenrollados no serían eliminados por topo IV. Estas observaciones cuestionan el modelo precatenane. Es posible que en las moléculas que se replican activamente, el superenrollamiento no se difunda a través de las horquillas de replicación porque es posible que no puedan rotar libremente. The observation that replication complexes are anchored to the bacterial membrane ( Levine et al, 1998 ) suggests that there is a topological barrier that would prevent diffusion of the (+) supercoiling generated in the unreplicated portion as the fork advances to the replicated part. In this case, precatenanes would not form. Experimental evidence for precatenanes en vivo is not abundant and the few cases reported in the literature are indirect. The occurrence of knotted replication bubbles ( Olavarrieta et al, 2002a , b , c Sogo et al, 1999 Viguera et al, 1996 ) was considered to be the best available evidence indicating that precatenanes may form in (−) supercoiled, partially replicated molecules en vivo ( Postow et al, 1999). Further evidence supporting the occurrence of precatenanes en vivo comes from experiments using small circular plasmids replicated in Xenopus cell extracts. The significant increase in the number and complexity of catenanes after partial inhibition of eukaryotic topo II (the equivalent of prokaryotic topo IV) could only derive from pre-existing precatenanes ( Lucas et al, 2001). In most of these cases, though, replication was impaired either by stalling the forks or by inhibiting topo II. It is possible that precatenanes could form en vivo only if progression of the replication forks is permanently stopped or severely impaired. In other words, precatenanes might not form en vivo during unimpaired DNA replication. They would readily form in vitro, however, after DNA isolation and deproteinization, as then the forks would be free to rotate. It is interesting to note that in E. coli cells, the majority of topo IV activity is concentrated close to replication factories at the cell centre and occurs mainly late in the cell cycle ( Espeli et al, 2003 Sherratt, 2003 ). These findings could explain how topo IV is prevented from eliminating left-handed precatenanes in (−) supercoiled RIs if such precatenanes eventually form.

The topological changes that take place as a replicon replicates are just beginning to be unravelled. Until this apparent topo IV decatenation paradox is finally solved, it seems that during replication all the possible topological forms RIs can adopt could have some role. The topological cycle of a replicon appears to involve supercoiling, precatenation, knotting, catenation and decatenation (see Fig 3). Whether or not the changes that have been observed for small plasmids also apply to the large topological domains of bacteria and linear eukaryotic chromosomes remains to be shown.


Topological Transformations of Synthetic DNA Knots

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3 ALGORITHM

An implementation of this approximation to topological entropy is available at: http://www.math.psu.edu/koslicki/entropy.nb

3.1 Comparison to traditional measures of complexity

Other measures of DNA sequence complexity similar to this approximation of topological entropy include: previous implementations of topological entropy ( Kirillova, 2000), special factors ( Colosimo and de Luca, 2000), Shannon's metric entropy ( Farach et al., 1995 Kirillova, 2000), Rènyi continuous entropy ( Rènyi, 1961 Vinga and Almeida, 2004) and linguistic complexity (LC) ( Gabrielian and Bolshoy, 1999 Troyanskaya et al., 2002).

The implementation of topological entropy in Kirillova (2000) does not produce a single number representing entropy, but rather an entire sequence of values. Thus, while the implementation of Kirillova (2000) does distinguish between artificial and actual DNA sequences, Kirillova notes that the implementation is hampered by high-dimensionality and finiteness problems.

In Colosimo and de Luca (2000), it is noted that the special factors approach does not differentiate between introns and exons.

Low topological entropy of a sequence implies that it is ‘less chaotic’ and is ‘more structured’.

Thus, LC is the only other similar measurement of sequence complexity that produces a single number representing the complexity of a sequence. Like our implementation of topological entropy, the implementation of LC contained in Troyanskaya et al. (2002) also runs in linear time. A comparison of our implementation of topological entropy and LC is contained in Section 4.4.


Materiales y métodos

Anticuerpos.

The generation of the mAbs JJ316 and JJ319 has been previously described (12, 15). The other anti–rat CD28 mAbs used in this study originated from these published experiments but had not yet been characterized in detail. Anti–mouse CD28 (clone 37.51 reference 16), mouse anti–phosphotyrosine (clone 4G10), and mouse anti–human CD3 (clone UCHT1) was purchased from BD Biosciences. Mouse anti–human TCRζ (clone 6B10.2) and rabbit polyclonal antibodies to nuclear factor (NF)-κB p50, c-rel, and USF-2 were from Santa Cruz Biotechnology, Inc., and mouse anti–human ZAP-70 (clone 3.3.1 reference 17) was provided by A.D. Beyers (University of Stellenbosch, Matieland, South Africa). The generation of the anti–rat TCR mAb R73 was previously described (18).

Generation of mAbs Specific for Human CD28.

BALB/c mice were immunized repeatedly intraperitoneally with recombinant human CD28-Fc fusion protein and a CD28-transfected B lymphoma cell line. 3 d before cell fusion, animals were boosted intravenously. Fusion of spleen cells from immunized mice and X63Ag8.653 myeloma cells was performed by polyethylene glycol treatment according to standard protocols (15). Routinely, hybridoma cells secreting CD28-specific mAbs were subcloned once. Superagonistic anti-CD28 mAbs were subcloned twice.

Animales.

Lewis rats and C57BL/6 mice were bred at the Institute for Virology and Immunobiology, University of Würzburg. Mesenteric lymph nodes were taken from young adult animals and single cell suspensions were used for FACS ® analysis and T cell proliferation assays.

Cloning of DNA Constructs.

The rat CD28 cDNA (15, 19) was inserted into the cloning vector Bluescript pBS KS (−). Sequence analysis revealed that amino acid (aa) at position 85 is identical to the homologue mouse CD28 aa in contrast to the data bank (NCBI protein) information. Mouse CD28 cDNA was amplified from whole mouse lymph node cDNA using 5-GCGTCGACGGCCCTCATCAGAACAATGAC-3′ as the sense primer and 5-GGAAGCTTCCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ as the antisense primer and then cloned into the pCR 3-uni-expression vector (Invitrogen) or the cloning vector Bluescript pBS KS (−).

To generate the r/mCD28 1–37, the EcoNI/XhoI mouse CD28 cDNA fragment was cloned into the corresponding EcoNI/XhoI site present in the rCD28 sequence in pBS KS (−). The resulting chimeric construct was then cloned into the expression vector pCR 3-uni. The chimeric construct m/rCD28 1–37 was generated by inserting the EcoNI/XhoI rat CD28 cDNA fragment into the corresponding EcoNI/XhoI site present in mCD28 in pBS KS (−) and then cloned into the pCR 3-uni expression vector.

For the m/r CD28 1–66 construct, the rat part of the chimeric molecule was amplified by PCR using 5′-TCGCTCGAATGCCGAGTTCAACTGTGATGG-3′ as the sense and 5′-TTTTGCTCGAGCCCTGTCAGGGGCGGTACG-3′ as the antisense primer and cloned into the Mva1269I/XhoI site present in mCD28 in pBS KS (−). The chimeric construct was then subcloned into the expression vector pHβAPr-1-neo, as this vector exhibited a higher transfection efficiency in L929 cells compared with pCR 3-uni.

All point mutants were generated using the Quick Change kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. The following primers were used: mCD28 A64V, E65G: sense 5′-CCCAGTTTCGCTCGAATGTGGGGTTCAACTGCGACGGG-3′, antisense 5′-CCCGTCGCAGTTGAACCCCACATTCGAGCGAAACTGGG-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G: sense 5′-CCAGTTTCGCCCAAATGTGGGGTTCAA-3′, antisense 5′-TGGAACCCCACATTTGGGCGAAACTGG-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N: sense 5′-AACTGCGACGGGAATTTCGACAA-3′, antisense 5′-TTGTCGAAATTCCCGTCGCAGTT-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K: sense 5′-GACAACGAGAAGAGCAATGGAACT-3′, antisense 5′-AGTTCCATTGCTCTTCTCGTTGTC-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K, F98V: sense 5′-TGCAAAATTGAGGTCATGTACCCTC-3′, antisense 5′-GAGGGTACATGACCTCAATTTTGCA-3′ mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, T125A, S127T: sense 5′-TCTTTGTCATGCTCAGACGTCTCCTAAGC-3′, antisense 5′-GCTTAGGAGACGTCTGAGCATGACAAAGA-3′ mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G: sense 5′-CCCAGTTTCGCTCGAAAACGGGGTTCAACTGCGA-3′, antisense 5′-TCGCAGTTGAACCCCGTTTTCGAGCGAAACTGGG-3′, as well as sense 5′-TATCAGCCCCAGGTTTACTCGAAAACGG-3′, antisense 5′-CCGTTTTCGAGTAAACCTGGGGCTGATA-3′. All point mutants were cloned into the expression vector pHβAPr-1-neo. The correct generation of all chimeric constructs and point mutants was verified by sequencing.

The constructs mCD28 S62P, A64V, E65G and mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G were amplified using the primers sense 5′-GCGCCAATTGCCCTCATCAGAACAATGAC-3′ and antisense 5′-ATTTCGGATCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ and then cloned into the EcoRI/BamHI site of the retroviral pczCFG5 IZ vector. This is a derivative of the described pEYZ/MCS retroviral vector (20) in which the open reading frame coding for the EYFP-zeocin fusion protein was removed and an IRES/zeomycin cassette introduced instead. As control, a construct was used that contained the extracellular domain of rat CD28 coupled to the transmembrane and cytoplasmic domain of mouse CD28 (hereafter referred to as extracellular WT rat CD28). For this, the mouse part of the molecule was amplified using the primers sense 5′-TGCTCAGACGTCTCCTAAGCTGTTTT-3′, antisense 5′-GGAAGCTTCCCTGTCAGGGGCGGTACGCT-3′ and the PCR product was cloned into the AatII/HindIII site of rat CD28 in Bluescript pBS KS (−). The chimeric construct was cloned into the EcoRI site of pczCFG5 IZ.

Expression of Constructs in Cell Lines.

The constructs in the expression vectors pCR 3-uni or pHβApr-1-neo were stably transfected into L929 cells using lipofectamin (Life Technologies) according to the manufacturer's recommendations. Transfected cells were selected using RPMI 1640 medium (5% FCS Life Technologies) containing G418 (Pan Biotech GmbH) at a final concentration of 1 mg/ml. After 2 wk of selection the percentage of cells expressing the appropriate construct ranged between 30 and 90%. If the transfection efficiency was low (as the case for m/r CD28 1–66, mCD28 S62P, A64V, E65G and mCD28 S62P, A64V, E65G, D71N, R109K), the transfected cells were stained with anti-CD28 and positive cells were sorted using a FACSVantage™ cell sorter (Becton Dickinson) and further propagated in RPMI 1640 medium containing G418.

The TCR − 58 mouse T cell hybridoma (21) was first retrovirally transduced with a rat myelin basic protein-specific TCR (provided by T. Herrmann, University of Würzburg, Würzburg, Germany, and Herrmann, T., personal communication). The CD28 constructs in the retroviral vector pczCFG5 IZ were then introduced into these cells using retroviral infection. Recombinant retroviral vector supernatants were generated by cotransfection with vectors encoding VSV-G and pHIT 60 as previously described (22, 23). >90% of the cells were positive for the expression of the appropriate molecules when tested by FACS ® analysis.

FACS ® Analysis.

For FACS ® analysis, 5 × 10 5 cells were resuspended in PBS/0.1% BSA/0.02% NaN3 and incubated for 30 min with 0.5 μg purified antibody (for JJ316 and JJ319) or 100 μl culture supernatant (for all other anti–rat CD28 mAb) on ice followed by development with PE-labeled donkey anti–mouse IgG (Dianova). Flow cytometric analysis was performed with a FACScan™ flow cytometer (Becton Dickinson) and CellQuest™ software using logarithmic amplification of fluorescence signals from scatter-gated live cells.

T Cell Proliferation Assays.

Rat T cells were purified from lymph node cell suspensions by nylon wool passage. Routinely, T cells were enriched to >90% by this method whereas B cells and monocytes were efficiently depleted and made up <1% of the cell suspension. 10 5 purified T cells were used for the proliferation assay using either costimulatory conditions (immobilized anti-TCR mAb R73 and soluble anti-CD28 mAb) or mitogenic conditions (immobilized sheep anti–mouse Ig plus anti-CD28 references 12 and 13). Proliferation was determined by [ 3 H]thymidine incorporation.

Human T cells from freshly drawn peripheral blood were obtained from ficoll-purified PBMC and nylon wool passage. Routinely, purity was >90%. Cells were adjusted to 5 × 10 5 /ml and cultured in RPMI 1640 medium containing 10% autologous serum in 200 μl final volume in 96-well plates (Costar) that had previously been coated with 40 μg/ml donkey anti–mouse Ig antiserum (Dianova), followed by extensive washing and incubation with 0.003 μg/ml anti-CD3 mAbs (costimulation) or without anti-CD3 mAbs (direct stimulation) for 15 min on ice. After washing, soluble anti-CD28 mAbs were added to the cultures at a final concentration of 3 μg/ml (see Fig. 4, A and B) or as indicated (see titration in Fig. 4 C). As positive control, cells were stimulated with 5 μg/ml PHA and 200 U/ml IL-2. After 72 h, proliferation was measured by [ 3 H]thymidine incorporation.

Stimulation of 58 T Hybridoma Cells and IL-2 Measurement.

58 T hybridoma cells (21) transfected with either extracellular WT rat CD28, mCD28 S62P, A64V, E65G or mCD28(h) F60V, R61T, N63K, A64T, E65G were stimulated with either plate-coated anti-TCR mAb, a mitogenic anti-CD28 mAb (JJ316 for rat, 5.11A1 for human), a nonmitogenic anti-CD28 mAb (JJ319 for rat, 37.51 for the chimeric molecules), both at final concentrations of 10, 5, 2.5, and 1 μg/ml, or left untreated. After 2 d, the IL-2 content in the supernatant was tested using an Opti EIA mouse IL-2 detection kit (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions.

Modeling of the Mouse CD28 Structure.

The human CD28 monomer was modeled on the murine CTLA-4 structure (24) using the sequence alignment derived by Metzler et al. (25) and the program O (26). The dimer was constructed on the basis of the CTLA-4 homodimer observed in the crystals of the complex of human CTLA-4 and CD80 (26). Fig. 3 was drawn using BOBSCRIPT (27).

Stimulation, Immunoprecipitation, and Preparation of Nuclear Extracts.

T cells obtained by leukopheresis were purified to ∼90% purity by nylon wool passage. 10 8 cells were incubated for 1 h at 4°C with 5 μg/ml conventional (7.3B6) or mitogenic anti-CD28 (5.11A1) antibodies, or a mixture of 5 μg/ml anti-CD3 (OKT3) and 0.5 μg/ml conventional anti-CD28 antibodies. Cells were washed, incubated for 30 min at 4°C with 10 μg/ml rat anti–mouse IgG, and incubated for 0.5 min at 37°C before the addition of NP-40 lysis buffer (final concentration 1% NP-40, 25 mM Tris, pH 7.5, 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM pefabloc, 5 mM iodoacetamide, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF). Lysates were centrifuged (14,000 rpm for 10 min at 4°C) and the supernatant was added to protein G–Sepharose precoated with 5 μg ZAP-70 and TCRζ antibody. Beads were incubated with rotation for 2 h at 4°C, washed four times with lysis buffer, and samples were resolved by SDS-PAGE and Western blotted. Membranes were probed with anti-phosphotyrosine antibody and reprobed with antibodies to TCRζ and ZAP-70 to ensure comparable loading. For preparation of nuclear extracts, 2 × 10 7 cells were stimulated for 20 h on sheep anti–mouse IgG-coated plates as previously described (13) and the protocol of Schreiber et al. (28) was followed. Protein concentration was measured using the Bradford assay (Bio-Rad Laboratories) and 6 μg protein per lane was resolved by SDS-PAGE, Western blotted, and probed with antibodies to c-Rel and USF-2.


Abstracto

It has been proposed that new transcription modulations can be achieved via topological coupling between duplex DNA and DNA secondary structures, such as G-quadruplexes, in gene promoters through superhelicity effects. Limited by available methodologies, however, such a coupling has not been quantified directly. In this work, using novel magneto-optical tweezers that combine the nanometer resolution of optical tweezers and the easy manipulation of magnetic tweezers, we found that the flexibility of DNA increases with positive superhelicity (σ). More interestingly, we found that the population of G-quadruplex increases linearly from 2.4% at σ = 0.1 to 12% at σ = −0.03. The population then rapidly increases to a plateau of 23% at σ < −0.05. The rapid increase coincides with the melting of double-stranded DNA, suggesting that G-quadruplex formation is correlated with DNA melting. Our results provide evidence for topology-mediated transcription modulation at the molecular level. We anticipate that these high-resolution magneto-optical tweezers will be instrumental in studying the interplay between the topology and activity of biological macromolecules from a mechanochemical perspective.


Expresiones de gratitud

The authors thank Wayne L. Miller and Martin B. Ulmschneider for contributing figures, and are grateful to Nicholas N. Nickerson and Dyanne Brewer for their helpful comments and critical reading of the manuscript. S. T. I. is the recipient of a CIHR Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship doctoral award, a CIHR Michael Smith Foreign Study award, a CFC doctoral studentship, and an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology. J. S. L. holds a Canada Research Chair in Cystic Fibrosis and Microbial Glycobiology.


Ver el vídeo: Supercoiling (Enero 2022).