Información

¿Cómo los procesos de un osteocito establecen contacto con los procesos de las células adyacentes dentro de la matriz mineralizada?


¿Se forman los procesos y canalículos y se establecen los contactos después de que los osteocitos se incrustan en la matriz o se forman durante el proceso de incrustación en sí? ¿Hay alguna evidencia que sugiera alguno de los dos?


Los osteocitos se unen entre sí mediante extensiones citoplásmicas a través de uniones gap [1]. Las conexiones entre estas células se forman ya que eran osteoblastos y osteoide-osteocitos (preosteocitos tipo II) [1]. Los osteoblastos tienen mayor volumen que los osteocitos y la falta de matriz extracelular favorece su adhesión. A medida que comienzan a sintetizar la matriz extracelular, su volumen se reduce y esta matriz ocupa espacio entre las células, pero con respecto a las uniones intercelulares existentes alrededor de las cuales la matriz forma canalículos.


"Organización de osteoblastos" de Physio Muse - Dibujé esta figura con un dibujo perfecto, la imprimí a .pdf y la convertí a .jpg "> Wikipedia.

Los osteoblastos están conectados a través de uniones gap mediadas por la proteína connexin43 [2]. Los osteocitos maduros se adhieren a la matriz ósea mediante integrinas (alphavbeta3) [3].


Referencias:

  1. Colaboradores de Wikipedia, "Osteocyte", Wikipedia, The Free Encyclopedia, http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Osteocyte&oldid=618657480 (consultado el 27 de julio de 2014).
  2. Civitelli R. Comunicación célula-célula en el linaje osteoblastos / osteocitos. Arco. Biochem. Biophys. 2008 15 de mayo; 473 (2): 188-92. doi: 10.1016 / j.abb.2008.04.005. PMID de PubMed: 18424255.
  3. McNamara LM, Majeska RJ, Weinbaum S, Friedrich V, Schaffler MB. Fijación de los procesos celulares de los osteocitos a la matriz ósea. Anat Rec (Hoboken). Marzo de 2009; 292 (3): 355-63. doi: 10.1002 / ar.20869. PubMed PMID: 19248169.

Contenido

7.16 Las implicaciones de la biología de los osteocitos para la enfermedad ósea

La conectividad de los osteocitos y la organización lacunocanalicular pueden desempeñar un papel en la enfermedad ósea (para una revisión, véase la Ref. [309]). La formación temprana de dendritas mediante la inclusión de osteoides-osteocitos está polarizada hacia el frente de mineralización al que se orientan los procesos celulares. Los procesos celulares orientados hacia los vasos sanguíneos solo comienzan a aparecer cuando la mineralización comienza a extenderse por la célula [17]. La dendricidad de los osteocitos cambia según la orientación y con la formación de hueso estática y dinámica [310]. En el hueso sano, la conectividad de los osteocitos es alta y los procesos están orientados en la dirección del suministro de sangre [311]. En el hueso osteoporótico, hay una marcada disminución de la conectividad, así como desorientación de las dendritas, que aumenta con la gravedad [311]. Por el contrario, en el hueso osteoartrítico se observa una disminución de la conectividad, pero la orientación permanece intacta. En el hueso osteomalacico, los osteocitos parecen viables con alta conectividad, pero los procesos están distorsionados y la red es caótica [311]. Los cambios en la dendricidad de los osteocitos no solo podrían tener un efecto dramático en la función y viabilidad de los osteocitos, sino también en las propiedades mecánicas del hueso. Debe alcanzarse un equilibrio entre el número y la ramificación de dendritas para preservar la función y la viabilidad frente al número que disminuiría la resistencia ósea (fig. 7.5).

Figura 7.5. Se desconocen los efectos de la complejidad del sistema lacunocanalicular sobre la masa ósea o la salud. La complejidad puede aumentar con la edad del animal. Pueden producirse alteraciones de este sistema con la enfermedad [311]. Teóricamente, los cambios en la dendricidad de los osteocitos tendrían un efecto dramático en la función y viabilidad de los osteocitos y en las propiedades mecánicas del hueso.

La osteonecrosis es un hueso "muerto" que no se remodela. Como los osteocitos están muertos o ausentes en el hueso necrótico y como el hueso necrótico no se remodela, esto sugiere que se necesitan osteocitos viables para iniciar (re) modelar. La osteonecrosis puede ser causada por tratamiento con glucocorticoides, trastornos de lípidos, abuso de alcohol, radiación, traumatismo y anemia de células falciformes. Recientemente, también se ha descrito osteonecrosis de la mandíbula relacionada con bifosfonatos. Los mecanismos propuestos responsables de la osteonecrosis incluyen (1) teoría mecánica: osteoporosis y la acumulación de microfisuras trabeculares sin cicatrizar que dan como resultado fracturas por fatiga, (2) teoría vascular: la isquemia es causada por émbolos grasos microscópicos. El aumento de la presión intraósea debido a la acumulación de grasa conduce a un choque mecánico en el lecho vascular sinusoidal y una disminución del flujo sanguíneo, y una nueva teoría, (3) apoptosis de osteocitos: los agentes inducen la muerte de las células osteocíticas que resulta en hueso muerto que no se remodela. Hay varios artículos que apoyan el mecanismo de la falta de irrigación vascular debido a microfisuras o émbolos grasos [312-314]; sin embargo, también hay artículos que sugieren que el osteocito es el objetivo [201,315-317]. Si estas afecciones están mediadas por la muerte de las células osteocíticas, es probable que sean beneficiosas las terapias para prevenir esta aparición.

La viabilidad de los osteocitos puede desempeñar un papel importante en el mantenimiento y la integridad del hueso. La pérdida ósea debida a la osteoporosis puede deberse en parte a la muerte de las células osteocíticas [7,199]. Manolagas y col. han sido pioneros en analizar los mecanismos y las vías de señalización de factores como los estrógenos, los bisfosfonatos y la hormona paratiroidea sobre la viabilidad de los osteoblastos y los osteocitos y de los glucocorticoides sobre la apoptosis de los osteoblastos y los osteocitos. La muerte de las células de osteocitos se observa en pacientes con osteonecrosis del cuello femoral inducida por esteroides y alcohol [201,317], después de un trasplante renal, posiblemente debido a glucocorticoides y otros inmunosupresores, y con dosis altas de bisfosfonatos que provocan osteonecrosis de la mandíbula [318]. Claramente, la prevención de la muerte de las células osteocíticas podría prevenir la pérdida ósea o la osteonecrosis, por lo que también garantizaría el desarrollo de tales agentes terapéuticos.

Como los osteocitos osteoides y los osteocitos maduros regulan la mineralización y la homeostasis del fosfato, juegan un papel importante en la hipofosfatemia. Como se indicó anteriormente, los ratones sin Dmp1 tienen un fenotipo similar al de los ratones Hyp en los que Phex está mutado y ambos modelos son osteomalacicos con niveles elevados de FGF23 debido a la alta expresión en osteocitos [254]. Si el sistema lacunocanalicular de los osteocitos es un órgano endocrino que regula el metabolismo del fosfato, el desenmarañamiento de las interacciones de estas moléculas debería conducir a una mejor comprensión de las enfermedades de la hiper e hipofosfatemia, así como de las enfermedades renales y cardiovasculares. Los niveles elevados de FGF23 circulante se asocian con hipofosfatemia, ERC y enfermedad vascular. Un FGF23 elevado conduce a un aumento de la excreción renal de fosfato y la consiguiente hipofosfatemia y osteomalacia [319,320]. El tratamiento con anticuerpo FGF23 restauró los niveles de fosfato sérico en el modelo de ratón Hyp y corrigió el fenotipo osteomalacico [321] y el tratamiento de ratones sin Dmp1 con un anticuerpo FGF23 mejoró los defectos óseos aumentando los niveles de fosfato circulante [322]. En la ERC, los niveles séricos de FGF23 aumentan, particularmente en las últimas etapas de la enfermedad. Los niveles séricos elevados de FGF23 se han relacionado no solo con aterosclerosis, hipertrofia ventricular, mayor riesgo de enfermedad cardiovascular y calcificación vascular [323], sino también con deficiencia de hierro, anemia e inflamación [324]. Los tratamientos dirigidos a FGF23 proporcionan un potencial terapéutico significativo y no solo para enfermedades óseas sino también para otras enfermedades crónicas. El burosumab, un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra FGF23, fue aprobado en 2018 para el tratamiento de enfermedades hipofosfatémicas [325].

El osteocito puede ser el principal objetivo del exceso de PTH que provoca hiperparatiroidismo. La actividad de los osteoclastos está elevada, lo que puede deberse a un RANKL elevado, no solo en las células de la superficie ósea sino también en los osteocitos incrustados. Con estudios recientes que sugieren que los osteocitos son una fuente importante de RANKL y OPG in vivo, parece probable que los efectos perjudiciales de la PTH continua sobre el hueso estén mediados, al menos en parte, por el osteocito. La enfermedad ósea en un modelo de ratón de hiperparatiroidismo secundario podría revertirse mediante el tratamiento con OPG [326]. La regulación positiva dirigida de OPG en osteocitos podría contrarrestar los efectos negativos del hiperparatiroidismo.

Por el contrario, los efectos del tratamiento intermitente con PTH, que se sabe que son anabólicos, pueden estar mediados por la regulación a la baja de la esclerostina expresada por osteocitos. La propia esclerostina se ha convertido en un objetivo muy atractivo para la terapéutica para aumentar la masa ósea. Se demostró que los anticuerpos monoclonales contra la esclerostina protegen contra la pérdida ósea debido a la inmovilización de las patas traseras en un modelo de rata, aumento de la formación ósea y densidad mineral en el mono cynomolgus, y aumento de la expresión de marcadores de formación ósea como la fosfatasa alcalina, disminución de los marcadores de resorción ósea y leucocitos. a ganancias de hasta un 5,3% y un 2,8% en la densidad mineral ósea en las vértebras y la cadera humanas, respectivamente. El anticuerpo también revirtió la pérdida ósea después del tratamiento con dexametasona en ratones. El anticuerpo de esclerostina se ha prometido para la aplicación ortopédica, ya que también se ha demostrado que mejora la regeneración ósea y es útil para el tratamiento de fracturas (para una revisión, véase la Ref. [327]). Recientemente, la FDA no otorgó la aprobación para el uso de romosozumab, un inhibidor específico de la esclerostina, debido a posibles eventos cardiovasculares a pesar de los impresionantes efectos en el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica y relacionada con la edad y en la reducción del riesgo de fracturas. Los episodios cardiovasculares y los accidentes cerebrovasculares se notificaron con más frecuencia con romosozumab que con alendronato de bisfosfonato (0,8% frente a 0,3% para ambos) [328]. Esto podría deberse a los efectos positivos en la reducción del riesgo de eventos cardiovasculares [329]. Sin embargo, recientemente el Comité Asesor de la FDA votó 18 a 1 para aprobar el medicamento para el tratamiento de la osteoporosis, y fue aprobado para esta indicación en 2019.

Se desconoce el papel de los osteocitos en la enfermedad ósea inducida por cáncer, excepto en el mieloma múltiple. Los huesos de estos pacientes tienen un aumento de la apoptosis de los osteocitos que resulta en una disminución de los osteocitos viables que se cree que son potencialmente responsables del aumento de la activación de los osteoclastos que dan como resultado lesiones osteolíticas. La esclerostina está elevada en pacientes con mieloma múltiple y se correlaciona con una disminución de la masa ósea. Por lo tanto, se ha probado en ratones el anticuerpo contra la esclerostina. La deleción genética de Sost previno el mieloma múltiple sin afectar el crecimiento tumoral [330], y la inhibición de la esclerostina aumenta la masa ósea y la resistencia a las fracturas [331]. Además de la esclerostina, también se sabe que otros inhibidores de la señalización de Wnt, como DKK1 y la proteína soluble relacionada con Frizzled, sFRP1, están implicados en la destrucción ósea inducida por mieloma. Por tanto, el osteocito puede ser una fuente de estos factores en la enfermedad del mieloma múltiple. El campo de las interacciones de los osteocitos con cánceres metastásicos óseos y no óseos está en su infancia.


Tipos de células óseas

Tanto el tejido óseo compacto como el esponjoso se componen de 3 tipos principales de células óseas. Estas células óseas tienen distintas características, estructura y funciones consideradas esenciales. Estas células óseas son Osteoclastos, Osteoblastos, y Osteocitos.

Estas células óseas están incrustadas en la matriz del tejido óseo y realizan muchas funciones vitales.

Desde la producción de hormonas hasta la provisión de fuerza mecánica, las células óseas poseen propiedades y funciones milagrosas fundamentales para el funcionamiento normal de los huesos.

Este artículo ofrece una descripción general de las propiedades fundamentales de las células óseas junto con algunas funciones esenciales.


Osteon

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Osteon, la unidad estructural principal del hueso compacto (cortical), que consta de capas de hueso concéntricas llamadas laminillas, que rodean un largo pasaje hueco, el canal de Havers (llamado así por Clopton Havers, un médico inglés del siglo XVII). El canal de Havers contiene pequeños vasos sanguíneos responsables del suministro de sangre a los osteocitos (células óseas individuales). Las osteonas miden varios milímetros de largo y aproximadamente 0,2 milímetros (0,008 pulgadas) de diámetro y tienden a correr paralelas al eje largo de un hueso.

Las osteonas son formaciones características del hueso maduro y toman forma durante el proceso de remodelación o renovación ósea. El hueso nuevo también puede tomar esta estructura a medida que se forma, en cuyo caso la estructura se denomina osteona primaria. El proceso de formación de osteones y los canales de Havers que los acompañan comienza cuando el hueso tejido inmaduro y los osteones primarios son destruidos por células grandes llamadas osteoclastos, que ahuecan un canal a través del hueso, generalmente siguiendo los vasos sanguíneos existentes. Las capas de células formadoras de hueso, u osteoblastos, siguen a los osteoclastos y depositan hueso nuevo en los lados del canal; las capas de hueso formadas de esta manera estrechan lentamente el canal hasta que queda un túnel no mucho más grande que el vaso sanguíneo central. El suministro de sangre para los osteocitos pasa luego a través de estos canales, los canales de Havers. Los espacios entre osteones adyacentes están llenos de laminillas intersticiales, capas de hueso que a menudo son restos de sistemas de Havers anteriores. Los vasos transversales, que van perpendiculares al eje longitudinal de la corteza, se denominan canales de Volkmann.Los canales de Volkmann conectan osteones adyacentes y también conectan los vasos sanguíneos de los canales de Havers con el periostio, el tejido que cubre la superficie externa del hueso.

Este artículo fue revisado y actualizado más recientemente por Kara Rogers, editora sénior.


Materiales y métodos

Reactivos

A menos que se indique lo contrario, los reactivos y productos químicos estándar eran de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos) o Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, Estados Unidos). El colágeno de cola de rata era de Becton-Dickinson (Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos). La sal de magnesio de fosfato de ácido L-ascórbico n-hidrato era de Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA, Estados Unidos.

Animales

El ratón Ai9, en adelante tdTomato, era del Laboratorio Jackson, Bar Harbor, ME, Estados Unidos [B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM 9 (CAG & # x2013tdTomato) Hze, JAX Stock # 007909] y es un Ratón reportero Cre con un casete STOP flanqueado por sitios LoxP (Madisen et al., 2010). El casete STOP bloquea la transcripción de la variante de la proteína fluorescente roja tdTomato y se induce la fluorescencia de tdTomato después de la recombinación mediada por Cre. El ratón Dmp1-Cre de 10 kb fue proporcionado amablemente por el Dr. Jian Q. Feng (Facultad de Odontología de Texas A & # x0026M) y ha sido descrito previamente (Lu et al., 2007). Se generaron ratones transgénicos GFP-colágeno en nuestro laboratorio insertando un GFPtopacio etiqueta en el extremo N-terminal del colágeno pro & # x03B12 (I) de ratón bajo el control del promotor de colágeno tipo I de 3,6 kb (Kamel-Elsayed et al., 2015 y manuscrito en preparación). Estos ratones transgénicos se generaron en un fondo C57BL / 6N mediante inyección pronuclear en el Centro de Tecnología Transgénica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas, TX, Estados Unidos. Los ratones se criaron para generar ratones GFP-col + & # x2063 / & # x2212 / Dmp1-Cre + & # x2063 / & # x2212 / tdTomato + & # x2063 / & # x2212, que tienen colágeno verde fluorescente y un linaje rojo fluorescente reportero para preosteocitos / osteocitos. Los ratones fueron genotipados por PCR de muestras de ADN de la cola. Para los ratones tdTomato, la PCR se realizó de acuerdo con el protocolo del Laboratorio Jackson. La genotipificación de ratones transgénicos Dmp1-Cre se realizó usando el cebador directo, 5 & # x2032-CCAAGCCCTGAAAATCACAGA-3 & # x2032 y el cebador inverso, 5 & # x2032-CCTGGCGATCCCTGAACATG-3 & # x2032. El genotipado de ratones transgénicos GFP-colágeno se realizó usando el cebador directo 5 & # x2032-TCATCTGCACCACCGGCAAGC-3 & # x2032 y el cebador inverso 5 & # x2032-AGCAGGACCATGTGATCGCGC-3 & # x2032. La expresión de los transgenes fluorescentes se confirmó examinando biopsias de clip de cola bajo un microscopio de epifluorescencia de campo amplio Nikon TE300. Los experimentos con animales y la eutanasia se realizaron bajo un protocolo IACUC aprobado en la Universidad de Missouri Kansas City (UMKC) y se ajustaron a las pautas federales pertinentes. La instalación de animales de UMKC está aprobada por la AAALAC y el cuidado y la cría de animales cumplen con los requisitos de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (8ª ed.), Consejo Nacional de Investigación. Los animales se alojaron en grupo en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con ad libitum alimentos y agua a 22 & # x00B0C de temperatura constante y 45 & # x201355% de humedad.

Histología ósea fluorescente

Se prepararon fémures de ratones transgénicos GFP-colágeno de 8 semanas de edad o ratones Dmp1-Cre + & # x2063 / & # x2212 / tdTomato + & # x2063 / & # x2212 para criosección como se describió anteriormente (Kamel-Elsayed et al., 2015) . Brevemente, después de la fijación en paraformaldehído al 4% en PBS, los fémures se descalcificaron en EDTA al 10%, pH 7,4 durante 1 & # x20132 semanas, luego se equilibraron en sacarosa al 15% y luego al 30% en PBS antes de incrustar y congelar en el compuesto Tissue-Tek OCT ( Sakura Finetek USA Inc., Torrence, CA, Estados Unidos). Se cortaron secciones longitudinales de 6 & # x03BCm en un criomicrotomo Leica CM3050S (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Los portaobjetos se vieron sin teñir o los núcleos se tiñeron usando una incubación de 5 min en 4 & # x03BCg / ml 4 & # x2032-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) en PBS. Las secciones se montaron con cubreobjetos en glicerol: PBS 1: 1 con MgCl 1 mM2. Se tomaron imágenes de las secciones utilizando un objetivo de 20x 0,75 NA o 10x 0,45 NA en un microscopio de epifluorescencia de campo amplio Nikon E800 (Nikon Instruments Inc., Mellville, NY, Estados Unidos) con conjuntos de filtros optimizados para cada fluoróforo. Se tomaron fotografías digitales utilizando una cámara en color Optronics CCD (Optronics, Goleta, CA, Estados Unidos) interconectada con el software AnalySIS (Soft Imaging System GmbH, Muenster, Alemania).

Cultivo de células

A menos que se indique lo contrario, los reactivos de cultivo de tejidos eran de Gibco (Life Technologies Inc., Grand Island, NY, Estados Unidos), GE Healthcare Life Sciences (Marlborough, MA, Estados Unidos) o Mediatech Inc. (Herndon, VA, Estados Unidos). El suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) era de Hyclone Laboratories (GE Healthcare Life Sciences) o Atlanta Biologicals (Flowery Branch, GA, Estados Unidos). Las células primarias de la calota se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento que consistía en & # x03B1-Medio esencial mínimo (& # x03B1-MEM) que contenía FBS inactivado por calor al 10%, L-glutamina (LG) 2 mM y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina (P / S) en un 5% CO humidificado2 incubadora a 37 & # x00B0C. La preparación de estas células primarias se describe a continuación. Para los experimentos, las células se sembraron en placas sobre portaobjetos de cámara de cubreobjetos Lab-Tek recubiertos con cola de rata (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) a 4 & # x00D7 104 células / cm 2 de área de crecimiento en medio de crecimiento. En la confluencia (día 0), el medio se cambió a medio osteogénico que consistía en & # x03B1-MEM suplementado con 5% de FBS, 100 U / ml de P / S, 2 mM LG, 5 mM & # x03B2-Glicerofosfato (& # x03B2GP ) y 50 & # x03BCg / ml de ácido ascórbico, para promover la diferenciación osteogénica. En algunos experimentos se utilizó & # x03B2GP 0,5 mM durante los días 0 & # x20135 y luego se utilizó & # x03B2GP 5 mM desde el día 5 en adelante. Las células se cultivaron durante un máximo de 14 & # x201321 días, con el medio renovado cada 3 días. La formación de imágenes se inició en varios momentos como se indica en la sección de resultados. Durante la obtención de imágenes, se usó 100 & # x03BCg / ml fosfato de ácido L-ascórbico sal de magnesio n-hidrato en lugar de ácido ascórbico estándar, ya que es más estable en condiciones de obtención de imágenes.

Aislamiento de células calvarias primarias

Se aislaron células primarias de la calota de ratón de la calota de un ratón neonatal de 7 a 8 días de edad mediante digestiones secuenciales con tripsina y colagenasa usando una modificación de los métodos descritos previamente para ratas fetales (Harris et al., 1994 Dallas et al., 1995). Brevemente, los huesos parietal y frontal se diseccionaron asépticamente y se sometieron a cuatro digestiones secuenciales de 20 minutos en colagenasa al 0,2% / tripsina al 0,05% en MEM (sin aditivos) en una placa agitadora a 37ºC. Los digeridos 2 & # x20134 se mantuvieron como la población de células enriquecidas con osteoblastos y las células de primer o segundo pase se sembraron en placas para experimentos.

Imágenes de células vivas

Para la obtención de imágenes de células vivas, las células se colocaron en placas sobre portaobjetos de cámara de cubreobjetos Lab-Tek recubiertos con colágeno (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos) y se diferenciaron como se describe anteriormente. El día de la formación de imágenes, el medio se renovó con aditivos como antes, pero con 100 & # x03BCg / ml de sal de magnesio fosfato de ácido L-ascórbico n-hidrato (una forma más estable de ácido ascórbico). Las imágenes de células vivas se realizaron en un microscopio de epifluorescencia de campo amplio Nikon TE 2000E automatizado con etapa x, yyz motorizada de precisión utilizando un objetivo de 20x 0,75 NA con conjuntos de filtros optimizados para cada fluoróforo. El software & # x201CMetamorph & # x201D (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, Estados Unidos) controlaba el microscopio y los parámetros de imágenes multidimensionales. La temperatura se mantuvo constante a 37 & # x00B0C usando un gabinete de incubadora de microscopio (& # x201CThe Box & # x201D con & # x201CThe Cube, & # x201D Life Imaging Systems, Reinach, Suiza) y un 5% de CO humidificado2 La atmósfera se mantuvo usando un mezclador de gas (& # x201CThe Brick, & # x201D Life Imaging Systems) junto con una cámara de incubación superior de la etapa humidificada. Las imágenes se adquirieron para cada punto de tiempo bajo iluminación epifluorescente usando una cámara CCD enfriada Photometrics Coolsnap HQ con resolución de escala de grises de 12 bits. Se obtuvieron imágenes de campos de 450 & # x00D7 335 & # x03BCm a una resolución espacial de 696 & # x00D7 520 píxeles (con 2 & # x00D7 2 agrupaciones) cada 30 minutos durante hasta 14 días desde 5 planos ópticos, con medios actualizados cada 48 h . Las pilas de imágenes se procesaron en Metamorph utilizando el algoritmo & # x201Cbest focus & # x201D o seleccionando manualmente el mejor plano de enfoque y luego exportadas como archivos de pila de imágenes (.stk). El procesamiento de imágenes posterior a la adquisición, incluidos los ajustes de contraste, la combinación de colores, la conversión a pilas de 8 bits o RGB, el procesamiento de pilas y la compilación en películas se realizó mediante el software ImageJ. Las pilas de imágenes se registraron utilizando el complemento & # x201Cstackreg & # x201D en ImageJ (modo de traducción) (Thevenaz et al., 1998) para alinear las pilas de series de tiempo y corregir los fotogramas de imagen desalineados. Las pilas de imágenes alineadas se ensamblaron en películas usando ImageJ. Se aplicaron ajustes de gamma a algunas de las películas de colágeno-GFP para permitir la visualización de fibrillas de colágeno en puntos de tiempo tempranos debido al gran rango dinámico de intensidad de fluorescencia entre puntos de tiempo tempranos y tardíos y a algunas de las películas Dmp1-Cre / tdTomato para permitir mejor visualización de píxeles de baja intensidad en los límites de las celdas. Estos se indican en las leyendas de las películas complementarias.

Imágenes intravitales

Se realizaron imágenes intravitales en ratones de 2 semanas de edad. Los ratones se anestesiaron con 75 mg / kg de ketamina y 0,5 mg / kg de dexmedetomidina (Henry Schein Animal Health, Dublin, OH). Una vez bajo un plano profundo de anestesia, se preparó el sitio quirúrgico rasurando el pelaje en la parte superior de la cabeza con una maquinilla eléctrica y limpiando con betadino seguido de etanol al 70% (repetido tres veces). La piel que recubre el calvario se diseccionó asépticamente con tijeras de iris y se reflejó para exponer la superficie del calvario (principalmente los huesos parietal y frontal). El tejido conectivo adherente suelto se diseccionó suavemente de la superficie del hueso con fórceps estériles bajo un microscopio de disección. Luego, el ratón se inmovilizó utilizando un soporte estereotáxico personalizado diseñado para la plataforma del microscopio confocal invertido, con el ratón tendido con el lado ventral hacia arriba y la superficie calvarial expuesta apostada a una ventana de cubreobjetos de vidrio estéril, lo que permite obtener imágenes desde abajo. Para mantener la hidratación de la superficie calvarial expuesta, se colocó un gel de formación de imágenes que consistía en D-sorbitol 300 mM y carbomer940 al 0,5% pH 7,4 (Rothstein et al., 2006) entre la superficie calvarial expuesta y el cubreobjetos de vidrio. Para garantizar que se mantuviera la anestesia profunda, los animales se monitorizaron durante todo el período de formación de imágenes mediante la evaluación del reflejo de pellizco del dedo del pie, la frecuencia respiratoria y la comprobación de movimientos espontáneos u otros signos de malestar. La anestesia profunda se mantuvo administrando media dosis adicional de ketamina / dexmedetomidina si era necesario. Se inyectó solución salina estéril por vía subcutánea antes de la cirugía para mantener la hidratación (500 & # x03BCl / 10 g de peso corporal). Para prevenir la hipotermia, la temperatura del aire en la cabina de incubación del microscopio se mantuvo a 30 ° C. Al final del período de obtención de imágenes, mientras aún estaban bajo anestesia profunda, los animales fueron sacrificados humanitariamente.

Las imágenes intravitales se realizaron utilizando un microscopio confocal de barrido Leica TCS Sp5 II en modo de escáner resonante interconectado con el software LAS-AF (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las imágenes se adquirieron con una resolución espacial de 1024 & # x00D7 1024 píxeles utilizando un objetivo de 20x 0,7 NA con zoom digital 4x, un tamaño de orificio de 1,2 AU y un promedio de línea de 48. Se adquirieron imágenes para GFP-colágeno y fluorescencia tdTomato de 7 planos ópticos con un tamaño de paso de 2 & # x03BCm. El láser de 488 nm (salida del 15%) se utilizó para la excitación de colágeno-GFP y el láser de 543 nm (salida del 20%) se utilizó para la excitación de tdTomato. Las ventanas de recolección se optimizaron para cada fluoróforo usando el prisma Leica SP y el sistema de control deslizante sintonizable y la señal se recopiló usando detectores HyD. El procesamiento de imágenes posterior a la adquisición se realizó utilizando el software ImageJ, como se describe anteriormente.

Seguimiento celular y cuantificación de colágeno-GFP y dinámica de ensamblaje tdTomato

Para el seguimiento de las velocidades y los movimientos de las células, se utilizaron pilas de imágenes registradas y se trazaron las trayectorias de movimiento de las células individuales dentro de cada campo de película utilizando el complemento MTrackJ en ImageJ (Meijering et al., 2012). Como análisis adicional, las células que tenían sus trayectorias de movimiento representadas se calificaron según si surgieron al activar directamente la expresión de tdTomato o mediante la división mitótica de una célula que expresa tdTomato (nota: células que ya eran tdTomato-positivas al comienzo de las películas fueron excluidos de este análisis de puntuación). Para cuantificar la fluorescencia de colágeno-GFP y tdTomato a lo largo del tiempo en películas de lapso de tiempo a largo plazo, las pilas de películas sustraídas de fondo se midieron en ImageJ y el área de fibrillas de colágeno o el área de fluorescencia de tdTomato se cuantificó a partir de pilas con umbral utilizando el complemento de análisis de partículas en ImageJ (Meijering et al. ., 2012).


Discusión

Los osteocitos ocupan el espacio lacunar, residen dentro de la matriz ósea mineralizada y envían procesos celulares a través de pequeños túneles llamados canalículos para formar una red canalicular. De los principales tipos de células en el hueso, los osteocitos permanecieron desconocidos durante mucho tiempo y se definieron principalmente por su morfología y ubicación más que por su función 24. De hecho, los osteocitos tienen una extensa red a través de largos procesos celulares dendríticos. Numerosos procesos dendríticos conectan los osteocitos con los osteocitos adyacentes y con las células osteogénicas en la superficie ósea a través de uniones gap que contienen conexina43 (Cx43), el resultado es un sincitio funcional de células en todo el hueso 25. Numerosos datos sugieren que Cx43 y la unión gap contribuyen a la proliferación y diferenciación osteoblástica in vitro 26,27,28. Mientras tanto, en vivo Los estudios, los ratones nulos Cx43 muestran una formación ósea intramembranosa alterada y también muestran fuertemente que Cx43 puede estar involucrado en procesos de señalización osteoblástica 29,30.

Numerosos estudios han demostrado que los FGF canónicos, como el FGF2, actúan en el hueso. En comparación con FGF2, no se han estudiado en detalle otros FGF canónicos. Mientras tanto, un estudio anterior mostró que el tratamiento de la piel humana con KGF recombinante conduce a la expresión de marcadores fibróticos 31. La expresión de FGF7 pero no de FGF6 y FGF8 se detecta en el modelo 12 de células de osteoblastos primarios. Un estudio anterior identificó la interacción de FGF7 con FGFR2IIIb 32.

La vía de señalización Wnt se ha destacado en la regulación de la homeostasis ósea 33. La beta-catenina es el transductor obligatorio para la señalización canónica de Wnt que, según se informa, se acumula en el núcleo y se une a los factores de transcripción de la familia Tcf / Lef de la caja del grupo de alta movilidad (HMG) y luego estimula la expresión génica aguas abajo 34,35. Además, estudios recientes identificaron que los osteocitos, como mediadores centrales, controlan la vía de señalización de Wnt canónica en el hueso y, por lo tanto, inducen el anabolismo óseo 36. En estudios anteriores se ha demostrado que Cx43 en sí mismo es un objetivo de la vía de señalización de Wnt 37. La asociación de beta-catenina con la región promotora 5 'de Cx43 en células MLO-Y4 se determinó mediante ensayo CHIP, y además se demostró la asociación del promotor Cx43 con Pol II y LEF1 23.

En este estudio, encontramos lo siguiente: (1) el nivel de ARNm de FGF7 es más alto en comparación con otros miembros de la familia FGF tanto in vitro y en vivo. (2) FGF7 puede aumentar la expresión de Cx43 y promover el alargamiento de la unión gap, probablemente independiente de las vías de señalización intracelular que pueden implicar la acumulación de beta-catenina citoplasmática inducida por FGF7 concomitante y la translocación nuclear parcial.

Hay limitaciones en este estudio. Primero, aunque la línea celular MLO-Y4 ha demostrado ser una herramienta muy útil para estudiar osteocitos in vitro, no pueden proporcionar información sobre los cambios temporales en la expresión génica y la morfología que se producen cuando un osteoblasto se diferencia en un osteocito [24]. A medida que los osteocitos están ganando un interés cada vez mayor como objetivo de la terapéutica para aumentar la masa ósea. Esperamos seguir estudiando los efectos de FGF7 en los osteocitos primarios. En segundo lugar, hasta donde sabemos, los ratones deficientes en FGF7 desarrollaron una apariencia algo grasosa o enmarañada en el pelaje, especialmente entre los ratones machos mutantes. Además, el FGF7 no es necesario para el desarrollo de muchos órganos epiteliales mesenquimales, incluidas las glándulas salivales, riñón, pulmón, bazo, hígado, intestino delgado y corazón 38. Posteriormente, algunos estudios demostraron que los niveles de FGF-7 modulan la extensión del crecimiento de las yemas ureterales y el número de nefronas en el riñón 39. Y otros sugieren que la deficiencia de FGF7 altera la formación de sinapsis inhibitorias, lo que da como resultado el brote de fibras musgosas y una neurogénesis mejorada 40. En la actualidad, todavía faltan estudios que examinen si la deleción del gen Fgf7 afecta la formación ósea y la patología, o el fenotipo de los ratones con deficiencia de FGF puede no ser muy significativo debido a múltiples factores complicados que intervienen en este proceso de modulación. Sin embargo, en el estudio actual, mostramos cambios de Cx43 en osteocitos en respuesta a Fgf7 recombinado. Este resultado podría proporcionar evidencia del importante papel de Fgf7 en el comportamiento de los osteocitos. En tercer lugar, los efectos intracelulares de FGF7 activados a través de complicadas vías de transducción de señales, no podemos eliminar la participación de otros mecanismos de señalización. Muchas vías de señalización combinadas con otras vías no caracterizadas conducen finalmente a una mayor expresión de Cx43 y a la formación de numerosos canales de unión gap funcionales para acomodar los efectos de FGF7. En cuarto lugar, un estudio anterior mostró que la actividad de ERK es necesaria para el efecto completo de Cx43 sobre la respuesta de los osteoblastos a FGF2 41. Y otros sugieren que Runx2 es un factor de transcripción descendente de la señalización de ERK implicado en la facilitación mediada por FGF7 de la diferenciación inducida por DAG en ESC de ratón [17]. Furthermore, FGF7 treatment augments mineralization of rat BMSCs with increased expression of osteogenic marker genes and this augmentation is suppressed by inhibitors of JNK and ERK 19 . However, in the current study, we only focused on β-catenin signaling but not elucidated the mechanism of MAPK signaling pathway. It should be investigated in the next work.

Further studies need to clarify the concrete molecular mechanisms between Cx43, beta-catenin, and skeletal homeostasis. More detailed experiments using FGF7 and various osteoblastic cells will be needed to further confirm its exact role in bone formation. Last but not the least, we hope that we can explore bone cell behavior and bone physiology or pathology through an eye of the FGF7 in the future.


Primary Cultures of Chick Osteocytes Retain Functional Gap Junctions between Osteocytes and between Osteocytes and Osteoblasts

The inaccessibility of osteocytes due to their embedment in the calcified bone matrix in vivo has precluded direct demonstration that osteocytes use gap junctions as a means of intercellular communication. In this article, we report successfully isolating primary cultures of osteocytes from chick calvaria, and, using anti-connexin 43 immunocytochemistry, demonstrate gap junction distribution to be comparable to that found in vivo . Next, we demonstrate the functionality of the gap junctions by (1) dye coupling studies that showed the spread of microinjected Lucifer Yellow from osteoblast to osteocyte and between adjacent osteocytes and (2) analysis of fluorescence replacement after photobleaching (FRAP), in which photobleaching of cells loaded with a membrane-permeable dye resulted in rapid recovery of fluorescence into the photobleached osteocyte, within 5 min postbleaching. This FRAP effect did not occur when cells were treated with a gap junction blocker (18α-glycyrrhetinic acid), but replacement of fluorescence into the photobleached cell resumed when it was removed. These studies demonstrate that gap junctions are responsible for intercellular communication between adjacent osteocytes and between osteoblasts and osteocytes. This role is consistent with the ability of osteocytes to respond to and transmit signals over long distances while embedded in a calcified matrix.


See also

A hueso is a rigid tissue that constitutes part of the vertebrate skeleton in animals. Bones protect the various organs of the body, produce red and white blood cells, store minerals, provide structure and support for the body, and enable mobility. Bones come in a variety of shapes and sizes and have a complex internal and external structure. They are lightweight yet strong and hard, and serve multiple functions.

Bone healing, o fracture healing, is a proliferative physiological process in which the body facilitates the repair of a bone fracture.

Osteoblastos are cells with a single nucleus that synthesize bone. However, in the process of bone formation, osteoblasts function in groups of connected cells. Individual cells cannot make bone. A group of organized osteoblasts together with the bone made by a unit of cells is usually called the osteon.

In histology, osteoid is the unmineralized, organic portion of the bone matrix that forms prior to the maturation of bone tissue. Osteoblasts begin the process of forming bone tissue by secreting the osteoid as several specific proteins. When the osteoid becomes mineralized, it and the adjacent bone cells have developed into new bone tissue.

Osteopetrosis, literally "stone bone", also known as marble bone disease or Albers-Schönberg disease, is an extremely rare inherited disorder whereby the bones harden, becoming denser, in contrast to more prevalent conditions like osteoporosis, in which the bones become less dense and more brittle, or osteomalacia, in which the bones soften. Osteopetrosis can cause bones to dissolve and break.

Un osteoclast is a type of bone cell that breaks down bone tissue. This function is critical in the maintenance, repair, and remodelling of bones of the vertebral skeleton. The osteoclast disassembles and digests the composite of hydrated protein and mineral at a molecular level by secreting acid and a collagenase, a process known as bone resorption. This process also helps regulate the level of blood calcium.

Osteoprotegerin (OPG), también conocido como osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) o tumour necrosis factor receptor superfamily member 11B (TNFRSF11B), is a cytokine receptor of the tumour necrosis factor (TNF) receptor superfamily encoded by the TNFRSF11B gene.

Endochondral ossification is one of the two essential processes during fetal development of the mammalian skeletal system by which bone tissue is created. Unlike intramembranous ossification, which is the other process by which bone tissue is created, cartilage is present during endochondral ossification. Endochondral ossification is also an essential process during the rudimentary formation of long bones, the growth of the length of long bones, and the natural healing of bone fractures.

Intramembranous ossification is one of the two essential processes during fetal development of the gnathostome skeletal system by which rudimentary bone tissue is created. Intramembranous ossification is also an essential process during the natural healing of bone fractures and the rudimentary formation of bones of the head.

Ameloblasts are cells present only during tooth development that deposit tooth enamel, which is the hard outermost layer of the tooth forming the surface of the crown.

los dental follicle, also known as dental sac, is made up of mesenchymal cells and fibres surrounding the enamel organ and dental papilla of a developing tooth. It is a vascular fibrous sac containing the developing tooth and its odontogenic organ. The dental follicle (DF) differentiates into the periodontal ligament. In addition, it may be the precursor of other cells of the periodontium, including osteoblasts, cementoblasts and fibroblasts. They develop into the alveolar bone, the cementum with Sharpey's fibers and the periodontal ligament fibers respectively. Similar to dental papilla, the dental follicle provides nutrition to the enamel organ and dental papilla and also have an extremely rich blood supply.

los alveolar process is the thickened ridge of bone that contains the tooth sockets on the jaw bones that hold teeth. In humans, the tooth-bearing bones are the maxilla and the mandible. The curved part of each alveolar process on the jaw is called the alveolar arch.

Bone resorption is resorption of bone tissue, that is, the process by which osteoclasts break down the tissue in bones and release the minerals, resulting in a transfer of calcium from bone tissue to the blood.

Huesos planos are bones whose principal function is either extensive protection or the provision of broad surfaces for muscular attachment. These bones are expanded into broad, flat plates, as in the cranium (skull), the ilium (pelvis), sternum and the rib cage. The flat bones are: the occipital, parietal, frontal, nasal, lacrimal, vomer, hip bone, sternum, ribs, and scapulae. In the cranial bones, the layers of compact tissue are familiarly known as the tables of the skull the outer one is thick and tough the inner is thin, dense, and brittle, and hence is termed the vitreous (glass-like) table.

Receptor activator of nuclear factor kappa- Β ligand (RANKL), también conocido como tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 (TNFSF11), TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE), osteoprotegerin ligand (OPGL), y osteoclast differentiation factor (ODF), is a protein that in humans is encoded by the TNFSF11 gene.

Osteonecrosis of the jaw (ONJ) is a severe bone disease (osteonecrosis) that affects the jaws. Various forms of ONJ have been described over the last 160 years, and a number of causes have been suggested in the literature.

Tartrate-resistant acid phosphatase, también llamado acid phosphatase 5, tartrate resistant (ACP5), is a glycosylated monomeric metalloprotein enzyme expressed in mammals. It has a molecular weight of approximately 35kDa, a basic isoelectric point (7.6𔃇.5), and optimal activity in acidic conditions. TRAP is synthesized as latent proenzyme and activated by proteolytic cleavage and reduction. It is differentiated from other mammalian acid phosphatases by its resistance to inhibition by tartrate and by its molecular weight.

Bone remodeling is a lifelong process where mature bone tissue is removed from the skeleton and new bone tissue is formed. These processes also control the reshaping or replacement of bone following injuries like fractures but also micro-damage, which occurs during normal activity. Remodeling responds also to functional demands of the mechanical loading.

Transcription factor Sp7, also called Osterix (Osx), is a protein that in humans is encoded by the SP7 gene. It is a member of the Sp family of zinc-finger transcription factors It is highly conserved among bone-forming verterbrate species It plays a major role, along with Runx2 and Dlx5 in driving the differentiation of mesenchymal precursor cells into osteoblasts and eventually osteocytes. Sp7 also plays a regulatory role by inhibiting chondrocyte differentiation maintaining the balance between differentiation of mesenchymal precursor cells into ossified bone or cartilage. Mutations of this gene have been associated with multiple dysfunctional bone phenotypes in vertebrates. During development, a mouse embryo model with Sp7 expression knocked out had no formation of bone tissue. Through the use of GWAS studies, the Sp7 locus in humans has been strongly associated with bone mass density. In addition there is significant genetic evidence for its role in diseases such as Osteogenesis imperfecta (OI).

The human skeletal system is a complex organ in constant equilibrium with the rest of the body. In addition to support and structure of the body, bone is the major reservoir for many minerals and compounds essential for maintaining a healthy pH balance. The deterioration of the body with age renders the elderly particularly susceptible to and affected by poor bone health. Illnesses like osteoporosis, characterized by weakening of the bone's structural matrix, increases the risk of hip-fractures and other life-changing secondary symptoms. In 2010, over 258,000 people aged 65 and older were admitted to the hospital for hip fractures. Incidence of hip fractures is expected to rise by 12% in America, with a projected 289,000 admissions in the year 2030. Other sources estimate up to 1.5 million Americans will have an osteoporotic-related fracture each year. The cost of treating these people is also enormous, in 1991 Medicare spent an estimated $2.9 billion for treatment and out-patient care of hip fractures, this number can only be expected to rise.


What We Know About Bone Formation

We know that exercise stimulates bone formation. Surgeon and anatomist Julian Wolff observed this law of biology in the late 19th century, which is why we call it Wolff's Law. That law observes that in a healthy person or animal, bone will adapt to the loads under which it is placed.

We call that load mechanical load. Mechanical load describes the pressure that our muscles exert on our bones to create movement or resist pressure. Weight-bearing exercise places a mechanical load on your bones.

Bones sense this pressure with the help of osteocytes, the most abundant bone cells in the adult skeleton. Found in mineralized bone matrix,osteocytes are mechanosensitive, meaning they are sensitive to mechanical pressure. 1

When osteocytes sense pressure, they respond by releasing compounds called paracrine factors, which interact with stem/stromal cells in bone. These cells are progenitor cells with the ability to mature into cells with different functions. The paracrine factors send a message to the stem/stromal cells to develop into cells that will create new bone mass, like osteoblasts. This bone-creating process is called osteogenesis. 1

The process described above is how exercise results in new bone growth. We could also break it down into a chain of communication that looks like this:

  • You do weight-bearing exercise, which engages your muscles
  • Your osteocytes sense the pressure that your muscles are exerting on your bones
  • Your osteocytes respond by releasing paracrine factors
  • The paracrine factors signal stem/stromal cells to become cells that create new bone
  • Osteogenesis begins at the site of the pressure

New bone is formed in response to the pressure that muscle places on bone. This occurs because osteocytes sense mechanical pressure, then release compounds called paracrine factors that signal progenitor cells to become bone-forming cells that carry out the process of osteogenesis, which is the creation of new bone.


DISCUSIÓN

Here we show the establishment and characterization of a cell line with the features ascribed to osteocytes. This cell line was named murine long bone osteocyte, Y4 (MLO-Y4) to emphasize the fact that it was established from long bones, the bones that respond to increased mechanical stress with an increase in bone formation. Because the best marker for mammalian osteocytes at this time is their morphology, 3, 16-18 this cell line was selected on the basis of expression of dendritic processes, a characteristic morphologic feature of osteocytes. Although osteocyte-specific antibodies are available for avian cells, 19, 20 none are available for mammalian osteocytes at this time.

The characteristics of the MLO-Y4 cell line as compared with primary osteoblast cells and to two osteoblast cell lines MC3T3-E1 and OCT-1. ↗, increased activity in the culture period ⟷, no change during the culture period +, detectible, —, not detectible Western, Western blot analysis EA, enzyme assay RIA, radioimmunoassay RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction analysis.

MLO-Y4 cells express proteins also expressed by osteoblasts such as osteocalcin, osteopontin, connexin 43, CD44, ALP, and type I collagen but in relative amounts described for osteocytes. The low expression of ALP and high expression of osteocalcin by MLO-Y4 cells supports the hypothesis that the MLO-Y4 cell line is osteocyte-like as reports by others show this pattern of expression in primary osteocytes. 3 However, the low expression of type I collagen in MLO-Y4 cells compared with osteoblasts contrasts with a report by Aarden and coworkers 4 but is in agreement with reports by others 21, 22 and by Nijweide and coworkers who have found that type I collagen is produced in relatively low abundance by osteocytes compared with osteoblasts (personal communication). Our results are also in conflict with the reports by Hughes and coworkers 3 and Nakamura and coworkers 14 who used immunohistochemical techniques to show that osteocytes are positive for CD44, whereas osteoblast and lining cells are negative. However, Hassan and coworkers 23 have recently shown that osteoblasts at different stages of maturation express mRNA and protein for CD44 both in vivo and in vitro. In the present study, both osteoblast cell lines tested, MC3T3-E1 and OCT-1, primary osteoblasts, and MLO-Y4 express CD44. Also recently, a human preosteocytic cell line (HOB-01-C1) has been established and characterized 24 Not only was this preosteocytic cell line positive for CD44, but so were the osteoblastic cell lines used for comparison. These data suggest that CD44 is not a specific marker for osteocytes.

Gap junctions are conduits for cell-to-cell communication (for review, see Edelson 25 ). Gap junctions penetrate the cell membranes of two communicating cells to allow the flow of low molecular weight signaling molecules such as Ca 2+ , cAMP, and inositol triphosphate. Gap junctions are composed of structurally related proteins known as connexins. Several connexins have been shown to be expressed by osteoblasts. 26-30 By Northern analysis, MC3T3-E1 cells have been shown to express large amounts of connexin 43 mRNA, 31 and cultured osteoblasts from newborn rat cal-varia also have been shown to express large amounts of this protein. 26 Because the expression of connexin 43 has recently been described for osteocytes in vivo, 11 we examined MLO-Y4 cells for expression of this gap junction protein. We were surprised to find very large amounts of connexin 43 protein produced by the MLO-Y4 cells, especially when compared with equivalent amounts of brain tissue (the positive control). Our data suggest that osteocytes may be the major source of connexin 43 in bone, especially when compared with osteoblasts.

OSF-2, a marker for osteoblasts, was recently cloned from an MC3T3-E1 library and shown to have homology with an insect protein, fasciclin 1, that functions as a hemophilic adhesion molecule. 10 OSF-2 is expressed in primary osteoblasts, MC3T3-E1 cells, and in lung tissue. Brain, heart, kidney, liver, muscle, placenta, spleen, testis, and thymus are negative for this marker. It is not known if OSF-2 is expressed by osteocytes or other bone cells. The cell line MLO-Y4 does not express OSF-2 mRNA when compared with the osteoblast cell lines OCT-1 and MC3T3-E1 and primary osteoblasts analyzed in the same experiments. Therefore, OSF-2, a putative bone adhesion molecule, is a negative marker for this cell line and may be a negative marker for osteocytes in vivo. This remains to be determined.

Two osteoblastic cell lines were previously established from the same strain of transgenic mice used in the present study. 6 These transgenic mice possess a 2.6 kb fragment of the rat osteocalcin promoter driving the expression of SV40 large T-antigen. Several studies have demonstrated the usefulness of using tissue-specific promoters and SV40 large T-antigen for developing immortalized cell lines. 32, 33 These cell lines, termed OCT-1 and OCT-2, were classified by their capacity to differentiate into cells with osteoblast characteristics. OCT-1 and OCT-2 were derived from the sequential digestion of the calvaria of one founder transgenic mouse. In contrast, in the present experiments, cells were isolated from the long bones of young 14-day-old mice through a series of digestions designed to select for cells encapsulated within the mineralized bone matrix. Although derived from the same strain of transgenic mice, the osteocyte cell line appears to be distinctly different from and produces large amounts of osteocalcin in contrast to the OCT-1 and OCT-2 cells.

Lanyon and coworkers 35-37 have performed numerous studies examining the effects of mechanical loading on bone in vivo and propose that the osteocyte is the major cell responding to mechanical stress. Sensors and/or tranducers on osteocytes appear to respond to load-induced strain. Glucose 6-phosphate dehydrogenase activity increases transiently in osteocytes soon after loading, and loading also appears to induce PGE2 and PGI2 production by these cells. Isolated osteocytes, but not osteoblasts nor periosteal fibroblasts, react to pulsating fluid flow with a release of PGE2. 37 Lean and coworkers 38 have shown that osteocytes respond to mechanical loading with an increase in mRNA for insulin-like growth factor I within 6 h. Mikuni-Takagaki and coworkers 39 concluded from their studies that isolated osteocytes respond differently from young osteocytes and osteoblasts to both low, physiological strain and to higher magnitudes of strain. It will be of interest to conduct similar studies with the cell line MLO-Y4 to determine if the response of this cell line is similar to isolated primary osteocytes. This will be the focus of future studies.


Ver el vídeo: tejido óseo v (Enero 2022).