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¿El microscopio invertido también puede ser un microscopio de contraste de fase?


Leí en alguna parte que el microscopio invertido también permite la microscopía de contraste de fase. ¿Es eso cierto? ¿Todos los microscopios invertidos tienen esta capacidad? ¿Tienen otras funciones?

Muchas gracias de antemano.


Definitivamente cierto, un microscopio invertido es aquel en el que la óptica se coloca debajo de la muestra y la fuente de luz arriba, lo que proporciona una situación óptima para observar un cultivo vivo. Los anillos de fase que cambian la luz aparecen poco después de la fuente de luz. Para la fase, la orientación no importa, solo el orden:

Microscopio vertical

Orientación:

(arriba) ojo ---> objetivo ---> muestra ---> fase ---> fuente de luz

pedido:

ojo -> objetivo de fase compatible -> muestra -> fase de disco -> fuente de luz

Microscopio invertido

Orientación

(arriba) fuente de luz ---> fase ---> muestra ----> Objetivo ---> ojo

pedido

ojo -> objetivo compatible con la fase -> muestra -> disco de fase -> fuente de luz

No todos los microscopios tienen fase no, son una adición importante y costosa a un microscopio. Agregar fase no solo requería el disco de fase, sino también un objetivo compatible con la fase.


Microscopio invertido

El microscopio invertido está diseñado con la fuente de luz y la lente de "condensador" encima de la muestra.

La lente del condensador concentra la luz.

El "objetivo" y la torreta del microscopio están en la parte inferior. El objetivo enfoca la luz para producir una imagen real.

Microscopio invertido vs vertical

Básicamente, en un microscopio vertical, miras hacia abajo para ver la imagen y, con un modelo invertido, miras hacia arriba.

Este tipo se usa comúnmente en metalurgia, cultivo celular y para ver muestras acuáticas.

Este modelo de microscopio es una muy buena opción si la muestra que se va a ver está en suspensión o es muy grande y pesada.

El invertido se ofrece con dos modelos: rutina e investigación. Se puede comprar un microscopio vertical como modelo más pequeño para uso de los estudiantes, lo que influye en el precio.

Historia

Un fabricante de gafas holandés llamado Zaccharias Janssen Inventó el primer microscopio alrededor de 1590.

Simplemente una serie de lentes en un tubo, fue el precursor del microscopio compuesto de hoy.

Diagrama etiquetado de microscopio invertido
de olympusmicro.com

Una fuente de luz fue agregada por Anton van Leeuwenhoek, y las lentes mejoraron, a fines del siglo XVII.

Sin embargo, hasta el siglo XIX hubo pocas mejoras importantes en el microscopio óptico.

Luego, en 1850, John Lawrence Smith, miembro de la facultad de lo que ahora es la Universidad de Tulane, inventó el microscopio invertido.

Este fue un cambio radical de los microscopios existentes donde la muestra tenía que ser pequeña y preservada en un portaobjetos.

Por primera vez se pudieron observar ejemplares vivos y grandes.

Más información disponible aquí sobre la Historia del Microscopio y su invención.

Capacidades de microscopio invertido

Este es un excelente microscopio para muestras metalúrgicas y para la observación de muestras o tejidos vivos.

Por lo tanto, se puede examinar el proceso de división celular, lo que no es el caso con un microscopio compuesto convencional.

Lo que hace que un modelo invertido sea útil es la capacidad de mantener un entorno más natural para el espécimen, extendiendo así su vida. La visualización de procesos vitales valiosos se puede investigar durante más tiempo. Ésta es su principal ventaja sobre un microscopio óptico compuesto.

En la foto de la derecha: cultivo de hongos en una placa de Petri.

La muestra / cultivo grande se puede guardar en una placa de Petri grande para su visualización en lugar de en un portaobjetos. En un recipiente más grande con una tapa adecuada, naturalmente habría menos evaporación y más intercambio de gases para mantener la vida.

Esto no es posible cuando se coloca una muestra delgada debajo de un cubreobjetos en un portaobjetos donde la evaporación ocurre demasiado rápido.

Desventajas

La mayor desventaja es el costo.

Hay menos fabricantes y la ingeniería para fabricar el microscopio es más cara.

Esto significa que hay menos microscopios usados ​​de este tipo en el mercado y precios menos competitivos.

Además, todos los microscopios tienen una distancia de trabajo limitada para enfocar la muestra.

Cuando se usa el tipo invertido, esta dificultad se ve agravada por la realidad de mirar hacia arriba a través de contenedores de diferentes calidades ópticas y espesores.

Puede mirar a través del plástico, que tiene una corrección óptica muy diferente a la del delgado deslizamiento de vidrio en un portaobjetos estándar que se usa con un microscopio convencional.

Ventajas

Una sola gota de agua de un estanque muestra una diversidad de vida y su interacción a nivel microscópico. La capacidad de observar especímenes vivos con este microscopio ha contribuido enormemente al conocimiento de la biología molecular y celular.

Como se indicó anteriormente, el espécimen vivo también se puede observar durante un período de tiempo más largo.

Además, los microscopios invertidos permiten el uso de Kohler Illumination, que es una excelente opción, así como DIC y ópticas de contraste de fase (que crean diferentes tonos de brillo) que mejoran en gran medida la imagen para una mejor visualización en lugar de tener que teñir la muestra y así matarla.

En el caso de muestras grandes o pesadas, como las del muestreo metalúrgico, un microscopio convencional es inútil.

Pero el modelo invertido, por su diseño, es perfecto para el análisis.

Además, los modelos suelen tener puertos de conexión, que les permiten conectarse a una variedad de equipos de grabación digital.

La opción de registrar la interacción de un espécimen en su entorno permite la validación y revisión de las observaciones en tiempo real.

Fabricantes

Existen varios fabricantes de este tipo. Incluyen:

1/ Meiji Techo ofrece varios modelos invertidos, dependiendo de la aplicación prevista.

  • Para uso biológico, ofrecen varios modelos comenzando por el Omano OM 900
  • El extremo superior Meiji TC5500 / TC5600 - Microscopio biológico epifluorescente
  • Un microscopio metalúrgico, el básico Omano OMM300T - Microscopio metalúrgico polarizado invertido
  • El todavía rentable Meiji IM7100 - Microscopio metalúrgico de campo claro invertido

2/ UNICO ofrece varios microscopios biológicos invertidos en su UNICO IV950 Serie de microscopios.

  • Estos microscopios están diseñados para cultivos de tejidos, así como para microbiología y celular.
  • UNICO no incluye microscopios metalúrgicos invertidos en su sitio web.

AmScope disponible en Amazon.com es un fabricante conocido por su calidad y ofrece microscopios invertidos.

Si bien el costo puede ser algo prohibitivo, no hay mejor microscopio en el mercado para observaciones en vivo.

Al comprar, busque accesorios que estén fácilmente disponibles (como en Amazon.com) para lo que desea hacer y que le permitirán crecer con el equipo.

Recomendaciones de MicroscopeMaster

Hay una gama de precios en el mercado con fabricantes confiables para estos microscopios, sin embargo, vale la pena revisar la gama de microscopios invertidos Amscope y Omax por su calidad frente a su precio.


Definición de microscopio invertido

Los microscopios invertidos son casi similares a un microscopio simple, pero todos los componentes se colocan en la condición invertida.

El microscopio invertido viene con su propia fuente de luz y una lente de condensador. Que se encuentran en la parte superior del microscopio y apuntan hacia abajo. Mientras que los objetivos y la torreta se encuentran debajo del escenario, apuntando hacia arriba.

En este microscopio, observamos la muestra desde abajo (hacia arriba) en lugar de desde arriba.

Los microscopios invertidos vienen con tres a seis lentes de objetivo. El poder de aumento de estos lentes varía de 4x a 40x.

En 1850, un miembro de la facultad de la Universidad de Tulane, J. Lawrence Smith, inventó por primera vez el microscopio invertido.


Partes de un microscopio invertido

Un microscopio invertido está construido con muchas de las mismas partes que el microscopio compuesto tradicional. Sin embargo, las partes simplemente están dispuestas de manera diferente para cambiar la trayectoria de la luz. La luz de la fuente de luz desciende a través del condensador y se refracta a través de la muestra colocada en la plataforma de montaje.

Se coloca un dispositivo de visualización fotográfica debajo del objetivo para captar la luz reflejada y formar una imagen ampliada. Sin embargo, este diseño simple se puede modificar de varias formas diferentes para microscopios de fluorescencia, contraste de fase, confocales o digitales.

  • FUENTE DE ILUMINACIÓN: Tradicionalmente, la fuente de iluminación consiste en una simple bombilla halógena alojada dentro de una cámara de luz, equipada con un diafragma y un condensador. Un diafragma simplemente ajusta la cantidad de luz que se emite desde la fuente, lo que permite diferentes niveles de brillo. En los microscopios invertidos modificados, como los microscopios de fluorescencia, las lámparas halógenas se sustituyen por fuentes monocromáticas como las lámparas de xenón y los láseres.
  • CONDENSADOR: El condensador instalado justo debajo de la fuente de luz concentra la luz en un solo cono de luz. La concentración de luz ayuda a producir una imagen mucho más nítida.
  • ETAPA DE MONTAJE: La platina de montaje en un microscopio invertido generalmente es fija y no se puede mover.
  • LENTE OBJETIVA: La luz refractada a través de la muestra es capturada por la lente del objetivo para formar una imagen real. Un juego de lentes objetivo está montado alrededor de una pieza nasal para permitir diferentes niveles de aumento de la muestra. La distancia focal, es decir, la distancia entre la muestra y el objetivo, se puede ajustar usando las perillas de enfoque grueso y fino. Para obtener más información sobre las perillas de enfoque grueso y fino, consulte Ajuste grueso y ajuste fino del microscopio: explicación.
  • PIEZA OCULAR / DISPOSITIVO DE FOTOGRAFÍA: Se puede utilizar un simple juego de lentes oculares o un dispositivo fotográfico complejo para convertir la imagen real producida por la lente del objetivo en una imagen virtual que se puede ver con el ojo.

Microscopios invertidos

Recientemente, me convertí en el orgulloso propietario de un microscopio invertido Olympus CK2 con el resultado de algunos daños en mi saldo bancario. Sin embargo, me encuentro usándolo cada vez más a menudo en lugar de un microscopio convencional. Las razones de esto se discuten en este artículo. La Olympus CK2 con y sin cabezal trinocular se ilustra en la fotografía de la derecha. Tengo el modelo a la derecha con el tubo trinocular.

Debo comenzar mis comentarios con las limitaciones de mi conocimiento. Difícilmente soy un experto en el tema de los microscopios invertidos. Toda mi experiencia con microscopios invertidos se limita a las varias semanas que he pasado con mi CK2 (que tengo entendido que Olympus ya no está haciendo con preferencia a algunos modelos CK más nuevos y más caros). No he probado otros microscopios invertidos, aunque tengo un folleto para los modelos de corrección infinita (IX) mucho más caros de Olympus.

¿Qué es un microscopio invertido?

Como sugiere su nombre, un microscopio invertido está al revés en comparación con un microscopio convencional. La fuente de luz y el condensador están en la parte superior sobre el escenario apuntando hacia abajo. Los objetivos y la torreta están debajo del escenario apuntando hacia arriba. Lo único que es `` estándar '' es que (1) se coloca una muestra (según lo dictan las leyes de la gravedad) en la parte superior del escenario y (2) gracias a Dios, el tubo binocular o trinocular no está al revés sino en la posición estándar apuntando a un ángulo de visión convencional. Como resultado, uno está mirando hacia arriba a través de la parte inferior de lo que sea que contenga la muestra y está sentado en el escenario en lugar de mirar la muestra desde la parte superior, generalmente a través de un cubreobjetos, como en un microscopio convencional.

La siguiente ilustración se ha tomado del manual del propietario e identifica los distintos componentes:

¿Cuáles son las ventajas de un microscopio invertido?

Antes de obtener la ventaja de un microscopio óptico invertido sobre un microscopio de luz tradicional, tengan paciencia conmigo por un momento mientras hablo de la ventaja de un microscopio óptico sobre un microscopio electrónico porque el microscopio invertido lleva esta ventaja un paso más allá. La ventaja fundamental de la microscopía óptica sobre la microscopía electrónica es la capacidad de observar organismos y tejidos vivos. Los diversos tipos de microscopios electrónicos requieren que la muestra se prepare minuciosamente (lo que puede incluir recubrirla con oro) y se coloque en una cámara de vacío para su observación. Obviamente, cualquier vida que haya en el espécimen no sobrevive a este proceso. Los microscopios de luz permiten observar un microorganismo vivo como un protozoo (ahora protista) mientras realiza sus diversas funciones vitales. Si bien un microscopio electrónico tiene un aumento y una resolución significativamente mayores que un microscopio óptico (y algunos tipos pueden producir imágenes en 3D espectaculares), solo produce una instantánea en el tiempo de un sujeto muerto.

Como puede atestiguar cualquiera que observe microorganismos durante minutos y horas seguidas, la imagen en movimiento que se despliega ante el observador de un organismo vivo puede revelar mucho sobre el organismo y su comportamiento que la instantánea momentánea de un organismo muerto nunca mostrará, no importa. qué detallado. Algunos organismos cambian tanto de forma de un segundo a otro que las microfotografías tomadas con segundos de separación de un organismo vivo pueden parecer de diferentes organismos. Es por esta razón, entre otras, que la microscopía óptica está bien y está viva como herramienta de investigación a pesar de las ventajas de la microscopía electrónica.

Un microscopio óptico tradicional requiere que la muestra se coloque en un portaobjetos de vidrio, generalmente debajo de un cubreobjetos (aunque hay objetivos diseñados para usarse sin un cubreobjetos). Por lo general, esto significa extraer una pequeña muestra del cultivo y colocarla en el entorno artificial creado por el portaobjetos y el cubreobjetos. Como resultado, la temperatura y el contenido de oxígeno de la muestra pueden cambiar rápidamente con respecto al cultivo. Además, los organismos estarán bajo mayor presión y en un espacio confinado antinatural como resultado del cubreobjetos. Además, la muestra se secará rápidamente a menos que se reponga repetidamente con agua. La pérdida de agua por evaporación y la adición periódica de agua pueden cambiar la salinidad de la muestra con frecuencia. Estos cambios imponen un estrés severo a los microorganismos que pueden afectar su comportamiento y / o matarlos en poco tiempo.

Algunas soluciones parciales a estos problemas incluyen hacer una pequeña cámara en el portaobjetos o usar un portaobjetos con un pozo o cámara incorporada y sellarlo para evitar la evaporación. Si bien esto evita que la muestra se seque rápidamente, la incapacidad de la muestra para intercambiar gases con el aire significa que en un día, unos días o una semana, los organismos morirán. Otra solución parcial es utilizar la técnica de caída colgante en un deslizamiento de pozo profundo que evita la presión y reduce el confinamiento, pero nuevamente es bastante temporal.

Por lo tanto, las observaciones a través de un microscopio estándar también están limitadas en el tiempo. Sus imágenes no son la imagen congelada de un microscopio electrónico, pero tampoco pueden permitir fácilmente un estudio de larga duración (es cierto que otra técnica disponible es utilizar portaobjetos de depósito especiales con cámaras de agua incorporadas que permiten que la muestra permanezca activa durante mucho tiempo). períodos, pero esto todavía requiere la preparación de la muestra y crea un entorno relativamente limitado para la vida en el portaobjetos.

No sería bueno si pudieras observar microorganismos en un recipiente grande en condiciones más naturales. Esto es lo que permite el microscopio invertido y, al hacerlo, amplía la ventaja del microscopio óptico. Debido a su configuración, puede colocar un cultivo completo o una muestra grande en un recipiente relativamente grande, como una placa de Petri, y observar todo el contenido del recipiente en condiciones más naturales (aunque ciertamente artificiales) y menos estresadas. Tal muestra puede mantener la vida durante un período mucho más largo. La tapa del recipiente ralentiza enormemente la evaporación y al mismo tiempo permite cierto intercambio de gases. La mayor cantidad de agua está menos sujeta a cambios rápidos de temperatura aunque, obviamente, si se almacena en una habitación, el agua adquirirá la temperatura de la habitación. Una muestra de estanque & quotscum & quot que he examinado durante varias semanas todavía sostiene la vida, aunque el carácter de esa vida ha cambiado significativamente con el tiempo desde que recogí la muestra por primera vez. Durante este período, a medida que cambiaba el medio ambiente en la placa de Petri, la vida que podía soportar cambió, pero todavía hay una gran cantidad de vida variada.

Dado que los microscopios invertidos se utilizan a menudo para observar organismos vivos y tejidos que pueden morir por tinción, a menudo proporcionan una "tinción quotóptica" mediante el uso de contraste de fase o DIC. Mi CK2 tiene contraste de fase. En lugar de utilizar el condensador de contraste de fase más sofisticado que se utiliza en un microscopio estándar, hay un control deslizante simple que atraviesa el condensador y contiene los anillos de fase necesarios. Solo los anillos de fase para los objetivos de menor potencia (por ejemplo, 10x y 20x) se pueden centrar mediante un proceso bastante crudo (aunque funciona). El anillo de fase para el objetivo de 40x no lo es, pero parece funcionar bien.


¿Cuáles son las desventajas de un microscopio invertido?

La primera desventaja es el costo. Los microscopios invertidos no son tan comunes como un microscopio con una configuración estándar, por lo que hay menos competencia tanto en el mercado nuevo como en el usado. Además, son más complejos y, por lo tanto, costosos de construir. Uno tiene que obtener una imagen que apunte hacia abajo desde debajo del escenario hasta los oculares frente al microscopio y apunte hacia arriba. No es necesario ser un ingeniero óptico para ver las complejidades de esto. Además, a diferencia de un microscopio estándar donde el enfoque se realiza simplemente moviendo la platina o el tubo óptico completo hacia arriba y hacia abajo, al menos en mi CK2, solo el conjunto de la torreta se mueve hacia arriba y hacia abajo. Todo esto agrega complejidad y costo al microscopio.

En un microscopio estándar, los objetivos de mayor potencia se optimizan para un espesor específico del vidrio de cobertura que es bastante delgado y uniforme. Con un microscopio invertido, es posible que esté mirando a través del fondo de diferentes recipientes con varios espesores y características ópticas variables. Con objetivos de mayor potencia, es ventajoso poder corregir las diferencias de grosor y en mi objetivo de 40x, hay un collar de corrección que le permite corregir los espesores del contenedor en un amplio rango (los collares de corrección también están disponibles en los objetivos de 20x). aunque la mía no la tiene y las imágenes me parecen bien). Sin embargo, nuevamente esto se suma a la complejidad y al costo del objetivo.

Además, recuerde que los objetivos estándar de alta potencia suelen tener una distancia de trabajo muy corta y deben acercarse mucho al sujeto para enfocar. Es por eso que a menudo están protegidos por un revólver retráctil para evitar dañar el objetivo si accidentalmente entra en contacto con el cubreobjetos y el portaobjetos. Debido al mayor grosor del fondo del recipiente por el que está mirando (en comparación con un cubreobjetos), es posible que un objetivo estándar de mayor potencia no pueda acercarse lo suficiente al sujeto para enfocar. Por lo tanto, los objetivos de mayor potencia en un microscopio invertido deben corregirse para una distancia de trabajo mucho mayor. Estos objetivos están designados al menos por Olympus como objetivos "LWD" (larga distancia de trabajo) y "ULWD" (distancia de trabajo ultra larga). Nuevamente, esto se suma al costo. Además, incluso con todas estas correcciones, no pueden compensar la relativa falta de claridad óptica y uniformidad de mirar a través de un buen cubreobjetos y, por lo tanto, la calidad de la imagen puede no ser tan buena como mirar a través de un microscopio convencional con objetivos comparables. (tenga en cuenta que las placas de Petri desechables de plástico suelen ser más adecuadas que la mayoría de las placas de Petri de vidrio porque son más delgadas, más uniformes y, por lo tanto, ópticamente superiores a las placas de vidrio estándar).

Sin embargo, un microscopio invertido también es excelente para ver la vida del estanque debajo de un cubreobjetos. El portaobjetos se invierte con el deslizamiento hacia el objetivo (el cubreobjetos permanece unido al portaobjetos a pesar del tirón hacia abajo de la gravedad debido a la tensión superficial creada por la gota de agua). Esto elimina los problemas de compresión que se experimentan con los soportes verticales. Además, los protozoos y otros invertebrados que normalmente se mueven a lo largo del sustrato se mueven rápidamente hacia la superficie superior de la barbotina, proporcionando un vínculo óptico mucho mejor con el objetivo. De hecho, esta es una de las razones por las que el microscopio invertido es un éxito entre los biólogos celulares.

El condensador también debe permitir una distancia de trabajo inusualmente larga para permitir que se coloquen contenedores más grandes en el escenario y en el CK2 se designa como ULWD. Supongo que como resultado de la corrección necesaria, tiene una `` N.A. '' (apertura numérica) de solo .3 y la fuente de luz halógena de 20 vatios, que es más que adecuada en mi microscopio estándar a alta potencia, es adecuada con el Objetivo 40x. Esto dificulta la fotomicrografía. Ojalá el CK2 tuviera una fuente de luz de 30 vatios o más (al igual que los modelos más caros de Olympus). Sorprendentemente, no he notado mucha diferencia en el brillo o la calidad de la imagen entre ver una placa de Petri con y sin su cubierta (incluso con condensación en el interior de la cubierta). Como resultado, tiendo a dejar la cubierta puesta cuando estoy viendo.

Otra desventaja es que el aumento máximo disponible en un microscopio invertido es más limitado. Por lo general, 40x es el objetivo de mayor potencia (aunque Olympus tiene un objetivo de 60x disponible en su modelo más caro). Los objetivos de inmersión en aceite 100x a menudo no están disponibles (aunque Olympus tiene uno para su serie IX de microscopios invertidos con corrección infinita). No sé si esto se debe a la dificultad de mantener una gota de inmersión en aceite boca abajo oa la dificultad de corregir un objetivo de potencia tan alto para distancias de trabajo largas.

Finalmente, una etapa mecánica es una opción de costo adicional en mi modelo y encontrar placas de Petri u otros recipientes que se ajusten exactamente a los soportes que vienen con ella es un poco complicado. Sin embargo, uno puede volverse experto después de un poco de práctica moviendo el contenedor a mano sin la etapa mecánica, incluso a alta potencia. Esto permite seguir más fácilmente a un microorganismo a través de un curso en diagonal o en zigzag a través de la inmensidad de una placa de Petri de 100 mm de diámetro que puede tener un cultivo con una profundidad de varios milímetros.

Sin embargo, cualesquiera que sean las desventajas que tenga un microscopio invertido, estas son superadas con creces por la ventaja fundamental de un microscopio invertido de aceptar un recipiente con un cultivo diverso de organismos vivos grande y relativamente longevo sin ninguna preparación.

Una posible introducción de menor costo a los microscopios invertidos

Como antes Micscape Según han señalado artículos sobre microscopios de campo, tanto el microscopio de campo Swift actualmente disponible como los microscopios de campo Nikon Model H que ya no se fabrican son formas de microscopios invertidos. Nikon incluso ofreció un objetivo especial de inmersión en aceite de 100x para su microscopio. El microscopio McArthur es similar y también puede estar disponible (haga clic en & quotNikon Model H & quot y & quotMcArthur para ir a los artículos de Micscape correspondientes). La diapositiva se coloca encima de los objetivos y se mira hacia arriba a través de la parte inferior de la diapositiva. Pueden proporcionar un medio menos costoso de utilizar un microscopio invertido si hay suficiente espacio para una placa de Petri u otro recipiente en el pequeño escenario entre el escenario y la fuente de luz (aparentemente, la Nikon no tiene mucho espacio). Tenga en cuenta que el Swift no es de ninguna manera económico y sospecho que los otros, si están disponibles en el mercado usado, también están en la misma categoría. Además, no he tenido experiencia con ninguno de ellos.

Expresiones de gratitud

Me gustaría agradecer a Bill Amos y Ron Neumeyer por revisar un borrador de este artículo y darme sus aportes que se reflejan a lo largo de la versión final. También me gustaría agradecer a mi esposa, Sally-Jo, por tomarse el tiempo para leer un borrador de este artículo y brindarme algunos comentarios útiles.

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¿El microscopio invertido también puede ser un microscopio de contraste de fase? - biología

Los componentes ópticos de contraste de fase se pueden agregar a prácticamente cualquier microscopio de campo claro, siempre que los objetivos de fase especializados se ajusten a los parámetros de longitud del tubo y el condensador acepte un anillo de fase anular del tamaño correcto. Todos los principales fabricantes proporcionan accesorios de contraste de fase para sus microscopios de investigación y enseñanza, tanto en configuración vertical como invertida (cultivo de tejidos).

Figura 1 - Componentes ópticos de contraste de fase

Los componentes de contraste de fase típicos disponibles para los microscopios de investigación verticales Nikon de la serie Eclipse se ilustran en Figura 1, aunque otros fabricantes también producen accesorios similares. El condensador presentado en Figura 1 es un universal sistema diseñado para aplicaciones que utilizan una amplia gama de aumentos (entre 2x y 100x) y accesorios para varias técnicas de mejora del contraste, incluido el contraste de interferencia diferencial (DIC), campo oscuro y contraste de fase. Los objetivos que contienen placas de fase interna se ofrecen con una variedad de factores de corrección óptica, que van desde acromáticos simples hasta apocromáticos planificados. Además, las placas de fase están disponibles con varios niveles de atenuación de frente de onda envolvente para producir diferentes grados de contraste e intensidad de fondo. Los fabricantes de lentes de objetivo de microscopio, como Nikon, suelen producir lentes de fase positiva y negativa.

Para alinear el anillo del condensador con la placa de fase en el plano focal posterior del objetivo, un telescopio de fase (como se ilustra en Figura 1) que se inserta en uno de los tubos de observación del ocular del microscopio. Un kit de accesorios de fase completo varía en costo desde varios cientos hasta varios miles de dólares, dependiendo del factor de corrección del objetivo, la complejidad y la corrección óptica del condensador de la subplaca, y si se incluye o no un telescopio de fase. Las siguientes secciones describen estos componentes con mayor detalle y presentan una guía para la configuración y alineación de microscopios de contraste de fase.

Diseño de anillo de condensador

Los anillos de contraste de fase (anillo es el término latino para anillo, siendo el plural annuli) utilizados en el condensador de la subplaca en un microscopio vertical, o dentro de la torreta del condensador en el pilar de iluminación de un microscopio invertido, deben adaptarse específicamente a un objetivo particular equipado con una placa de fase correspondiente. Por ejemplo, un objetivo de 20x y un objetivo de 100x, los cuales contienen una placa de fase cerca del plano de difracción (plano focal trasero), requerirán anillos de condensador que tengan diferentes diámetros que correspondan al aumento del objetivo y la apertura numérica. Al hacer coincidir el anillo del condensador con la placa de fase del objetivo, el microscopio se puede alinear para superponer los rayos de luz iluminadores que pasan a través del anillo sobre el anillo de fase del objetivo para lograr una iluminación de contraste de fase.

La mayoría de los sistemas condensadores universales populares diseñados para microscopía de contraste de fase están equipados con tres o más diafragmas anulares extraíbles, que están disponibles para su uso con objetivos 4x, 10x, 20x, 40x, 60x y 100x que contienen las placas de fase adecuadas. los Ph1 (o equivalente) el anillo del condensador, que contiene la apertura más pequeña, está diseñado para utilizarse con los objetivos de menor potencia 10x y 20x. Los objetivos de aumento intermedio (40x y 60x) utilizan el Ph2 anillo, mientras que los objetivos de 100x de mayor potencia (y apertura numérica) requieren el Ph3 anillo, que contiene la mayor apertura. Un anillo de condensador especializado (PhL) se utiliza con objetivos de bajo aumento (4x y 5x) cuando la lente oscilante del condensador se retira de la vía óptica o en condensadores de larga distancia de trabajo diseñados para microscopios de cultivo de tejidos invertidos.

Figura 2 - Configuración de torreta de condensador universal

Los insertos del anillo del condensador son placas circulares de aluminio que tienen un anillo estampado de diferentes dimensiones en el centro (como se ilustra en Figuras 1 y 2). Después de la operación de estampado, las unidades de disco anular se anodizan y se tiñen con un pigmento negro mate para absorber la luz parásita y garantizar que los rayos de luz que iluminan el anillo sigan una ruta definida. El tope de luz central, que varía en tamaño dependiendo de la apertura del objetivo y el rango de aumento, está ubicado en el centro de la placa y asegurado por tres pestañas delgadas espaciadas a intervalos de 120 grados. La placa anular se prensa o se pega en un marco circular (también anodizado y teñido de negro), que se encaja en una abertura redonda en la torreta del condensador.

Torretas modernas del sistema de condensador universal (ver Figura 2) suelen contener entre cinco y ocho posiciones de ranura abierta que se pueden equipar con placas de contraste de fase anulares, placas de prisma DIC Nomarski (Wollaston) o placas de parada de luz de campo oscuro. La construcción básica de estas placas es similar. Los topes de luz de campo oscuro se fabrican de manera similar a los diafragmas anulares de fase, pero el anillo es generalmente más ancho y tiene un diámetro mayor para permitir el paso de frentes de onda de luz altamente oblicuos. Por el contrario, los prismas DIC se cortan en losas circulares que se pegan en un marco anodizado y se insertan en la torreta.

Las placas de diafragma anular del condensador de contraste de fase se insertan en la posición adecuada en la torreta y se aseguran en su lugar con un clip de resorte que se monta dentro de la periferia de la abertura de la torreta. La tensión del clip de resorte fuerza la placa del anillo contra un conjunto de tornillos de ajuste (o pasadores roscados) utilizados para centrar el anillo en la vía óptica (como se ilustra en figura 3). Varios fabricantes ofrecen sistemas de condensador diseñados específicamente para contraste de fase que cuentan con un sistema de centrado de anillo integral. Estos condensadores generalmente tienen un conjunto de perillas de ajuste que se pueden accionar presionando el eje de cada perilla hasta que se trabe en un tornillo de ajuste anular. Después de que los tornillos estén enganchados, girar las perillas permitirá al operador centrar el anillo del condensador con respecto a la placa de fase del objetivo.

Figura 3 - Alineación de la placa del anillo del condensador de fase

Siempre que se utilice un condensador de microscopio universal para la observación de contraste de fase, el operador debe asegurarse de examinar la posición de la palanca del diafragma de apertura para asegurarse de que el diafragma se abre más ancho que el diámetro del anillo del condensador. De hecho, es una buena idea abrir siempre el diafragma en su posición más amplia durante las observaciones de contraste de fase. Varios fabricantes ofrecen condensadores diseñados exclusivamente para contraste de fase, que tienen un mecanismo de resorte que abre automáticamente el diafragma de iris de apertura del condensador cuando se gira un anillo de fase en la vía óptica, pero desactiva esta función para la observación de campo claro con el mismo condensador. Después de concluir los experimentos de contraste de fase, el microscopio puede volver al modo de campo claro y la apertura del diafragma del iris del condensador ajustada de acuerdo con la apertura numérica del objetivo.

Phase contrast condensers are available in a wide spectrum of optical correction levels, ranging from the basic Abbe design (no correction for chromatic or spherical aberration) to highly corrected aplanatic-achromatic systems that feature excellent performance. In addition, specialized phase contrast condensers are available with long working distance (LWD) optics, for both upright and inverted microscopes, in order to allow imaging of specimens contained in thick vessels. Many of the research-grade inverted microscopes have extra long working distance (ELWD) condensers with phase annuli that enable the observation of living cells in very large containers.

Interactive Tutorial - Phase Contrast Microscope Alignment

Learn how to align a phase contrast microscope and examine variations in specimen appearance through the eyepieces (at different magnifications) when the condenser annulus is shifted into and out of alignment with the phase plate in the objective.

The specifications for phase contrast accessories can vary significantly from one manufacturer to another, and there is no accepted standard for phase annular diaphragm (and objective phase plate) dimensions with respect to either numerical aperture or magnification. As a result, the phase contrast objectives from one microscope manufacturer cannot usually be coupled to the phase condenser from another (and vice versa).

Single annulus phase condensers were very popular at one time, but have been largely supplanted by the universal turret models. The older condensers require removal and insertion of different phase annuli as the objective is changed, a cumbersome and time-consuming task that often must be repeated frequently when examining fine specimen detail at several magnifications. Centration of the annular diaphragm in a single annulus condenser is accomplished in a manner similar to that of the newer, universal condensers. Either flat-blade or Allen-type threaded pins or screws are utilized to press the annulus plate against a leaf or coil spring unit within the condenser housing.

In order to adapt a standard Abbe, achromatic, or aplanatic substage condenser for phase contrast observations, a mechanism must be established for placing the annular diaphragm in or very near the condenser front focal (aperture) plane. Several condenser models are fabricated with the aperture iris diaphragm (always located in the focal plane) positioned at the base of the condenser, adjacent to slots designed to accept phase plates or darkfield light stops. Other condensers have the aperture plane located in the central region of the housing, which is relatively inaccessible to auxiliary components, such as a phase annulus.

Phase Contrast Objectives

The most important attribute of objectives designed for phase contrast microscopy is the presence of a specialized phase plate positioned in or very near to the diffraction or rear focal plane. Phase plates are not interchangeable between objectives and are often permanently etched into one of the internal lens elements. The etched ring is coated with a partially absorbing metallic film that reduces light transmission, and is usually made so that the phase of light passing through will be advanced by one quarter-wavelength relative to light that is transmitted through the rest of the glass.

Figura 4 - Phase Contrast Objective

A cut-away diagram of a typical phase contrast objective is illustrated in Figura 4. The inset illustrates the phase plate that is positioned in the rear focal plane. Other portions of the objective, including most of the internal lens elements, are identical in construction to standard brightfield microscope objectives. The range of phase contrast objectives available from the major manufacturers covers almost the complete gamut of correction factors, including achromatic, plan achromatic, fluorite, and apochromatic. These objectives are also available with coverslip correction collars (for dry high numerical aperture objectives) and for immersion techniques in water, glycerin, and oil. In addition, phase contrast objectives are manufactured that vary in the neutral density and retardation value of the phase plate to produce a wide spectrum of contrast levels in both positive and negative phase contrast modes.

Nikon and other manufacturers produce a variety of phase contrast objectives (see Figura 5) that vary in sign (positive or negative), and range in contrast from relatively low to very high. In positive phase contrast, the most common form, optically dense portions of a thin specimen appear dark against a background having a lighter shade of gray. Negative phase contrast renders specimens bright, but superimposed over a dark background, similar to darkfield illumination.

Presentado en Figura 5 is a comparison of digital images recorded using the currently available Nikon phase contrast objectives to demonstrate the contrast variations afforded by changes in phase plate neutral density and surround wavefront retardation (or advancement) levels. The images are the same viewfield from a fixed and mounted preparation of Zygnema filamentous algae. Figure 5(a), 5(b), and 5(c) compare the dark low low, dark low and apodized phase contrast objectives (DLL, DL, y ADL, respectively), which produce similar degrees of contrast on a relatively light gray background. The dark and bright medium Nikon phase contrast objectives (Figure 5(d) and 5(e)) demonstrate positive and negative phase contrast on a medium gray background. Properties of the individual Nikon phase contrast objectives are discussed below.

Figura 5 - Nikon Phase Contrast Objectives

The degree of specimen contrast afforded by the various types of phase contrast objectives is complicated by the fact that large fluctuations in refractive index and thickness can produce contrast inversions and significant light scattering from specimen areas away from the focal plane. The density of the absorptive material applied to the phase plate (to attenuate the surround light wavefront) and the phase shifting properties (that retard or advance the surround wavefront) of the phase plates have a dramatic effect on the results observed in a phase contrast microscope. Several important features of the various phase contrast objectives produced by Nikon are listed below.

  • DL (Dark Low - Medium Contrast) - DL objectives produce a dark image outline on a light gray background, and are the typical objectives utilized for all-purpose phase contrast observation. These objectives are designed to furnish the strongest dark contrast in specimens having a major difference in refractive index from that of the surrounding medium. The DL phase contrast objective is the most popular style for examination of cells and other semi-transparent living material and is especially suited for photomicrography and digital imaging.
  • DLL (Dark Low Low - Low Contrast) - Similar in design to the DL objective, the DLL series yields better images in brightfield illumination and is often employed as a "universal" objective in microscope systems that utilize multiple illumination modes such as fluorescence, DIC, brightfield, and darkfield. The DLL phase contrast objective produces less contrast than the DL objective, but features higher light transmission values, optical correction, and numerical aperture than the standard DL counterpart. A majority of the DLL phase contrast objectives offered by the manufacturers have fluorite or apochromatic aberration correction levels.
  • ADL (Apodized Dark Low - Medium Contrast) - Recently introduced by Nikon, the apodized phase contrast ADL objectives contain a secondary neutral density ring on either side of the central ring in the phase plate. Addition of the secondary rings assists in reducing unwanted "halo" effects often associated with imaging large particles or specimen features (such as nuclei, whole cells and fibers) in phase contrast microscopy. Apodized objectives are available in achromat optical correction and feature contrast levels similar to the DL objective series.
  • DM (Dark Medium - High Contrast) - DM objectives produce a dark image outline on a medium gray background. These objectives are designed to be used for high image contrast with specimens having small phase shifts or refractive differences, such as fine fibers, flagella, cilia, granules, and very small particles. Usually restricted to higher magnification objectives having large numerical apertures (fluorites and apochromats), DM phase contrast objectives perform well with very thin specimens, but often display a reversal of contrast when thick specimens are imaged.
  • BM (Bright Medium - High Negative Contrast) - Often referred to as negative phase contrast, BM objectives produce a bright image outline on a medium gray background. BM objectives are ideal for visual examination of bacterial flagella, fibrin bundles, minute globules, and for blood cell counting.

In order to enable the microscopist to quickly identify phase contrast objectives, many manufacturers inscribe important specifications, such as the magnification, numerical aperture, tube length correction, etc., on the outer barrel in green letters. The green alphanumeric color code serves to differentiate phase contrast objectives from ordinary brightfield, polarized, DIC, and fluorescence objectives which either use an alternative color code or the standard black lettering. In addition, phase contrast objectives have inscriptions on the barrel to indicate the objective is designed for phase contrast and also the matching annulus designation. A number of the most commonly encountered objective barrel engravings are described in tabla 1. Phase contrast objectives can also be easily identified by holding the objective up to a bright light and peering through the glass to observe the centrally-positioned dark phase ring.

Tabla 1 - Phase Contrast Objective Designations

AbreviaturaEscribe
Phase, PHACO, PCPhase Contrast
Ph 1, 2, 3, etc.Phase Condenser Annulus 1, 2, 3, etc.
DL, DLL, DM, ADLDark Low, Dark Low Low, Dark Medium,
Apodized Dark Low
(Positive Phase Contrast)
PL, PLL, PM, PHPositive Low, Positive Low Low,
Positive Medium, Positive High Contrast
(Positive Phase Contrast)
NL, NM, BM, NHNegative Low, Negative Medium,
Bright Medium, Negative High
(Negative Phase Contrast)

A typical series of phase contrast objectives having increasing numerical aperture and magnification are presented in Figura 6. As a general rule, when objective numerical aperture and magnification is increased, the phase plate width and diameter both decrease (and the condenser annulus size increases). Also illustrated in Figura 6 are cut-away diagrams showing the basic concepts behind positive and negative phase plate construction. The positive phase plate produces dark contrast and contains a partially absorbing film designed to reduce the amplitude of the surround wavefront. In addition, this plate contains phase retarding material designed to shift (retard) the phase of the diffracted light by 90 degrees. The negative phase plate also contains both phase retarding and partially absorbing materials. However, in this case, both materials are placed within the circular phase ring so that the undiffracted surround wavefront becomes the only species affected, and is attenuated and retarded in phase by 90 degrees.

Figura 6 - Objective Apertures and Phase Contrast Optics

Contrast is modulated in phase objectives by varying the properties of the phase plate, including the absorption of the metallic film (or anti-reflective coatings), the refractive index of the phase retarding material, and the thickness of the phase plate. Most of the phase plates available from manufacturers are produced by vacuum deposition of thin dielectric and metallic films onto a glass plate or directly onto one of the lens surfaces within the microscope objective. The role of the dielectric film is to shift the phase of light, while the metallic film attenuates undiffracted light intensity. Some manufacturers utilize multiple anti-reflective coatings in combination with the thin films to reduce the amount of glare and stray light reflected back into the optical system. If the phase plate is not formed on the surface of a lens, it is usually cemented between successive lenses that reside near the objective diffraction plane. The thickness and refractive indices of the dielectric, metallic, and anti-reflective films, as well as those of the optical cement, are carefully selected to produce the necessary phase shift between the complementary (diffraction) and conjugate (surround) areas of the phase plate. In optical terminology, phase plates that alter the phase of surround light relative to diffracted light by 90 degrees (either positive or negative) are termed quarter wavelength plates because of their effect on the optical path difference.

The Phase Telescope

If the condenser annulus, positioned in the front focal plane of the substage condenser, is not in exact alignment with the fixed phase plate in the objective (that is located centrally along the microscope optical axis), the contrast effect afforded by phase contrast optical systems will be dramatically compromised. In order to ensure proper microscope operation and to maximize the phase contrast effect, the objective rear focal plane should be examined with the condenser annulus in place to ensure that the microscope is properly aligned. This task can be accomplished using either a phase telescope, which can be inserted into one of the eyepiece observation tubes (in place of a normal eyepiece), or a Bertrand lens built into the microscope binocular (or trinocular) eyepiece tube assembly. The Nikon Ti2 inverted microscope features an internal Bertrand lens that allows for the phase ring to be either visualized by eye or directly on a camera for fine alignment, as well as an external phase contrast module for performing phase contrast imaging with objectives that don't have a phase annulus.

The phase telescope, also commonly referred to as an auxiliary telescope o auxiliary microscope, consists of a simple two or three lens telescope (illustrated in Figura 7) arranged to function as the objective and eyepiece combination of a miniature optical system that is intermediate between a telescope and microscope. The focal length of the phase telescope ranges from about 150 to 200 millimeters, enabling the device to focus on the objective rear focal plane when inserted into one of the microscope eyepiece observation tubes. The magnified view of the objective focal plane clearly reveals the spatial arrangement between the condenser annulus and objective phase ring when the phase telescope is properly focused. While viewing the fixed phase ring in the objective, the operator can then perform adjustments to the condenser annulus position to align the two for phase contrast observation (see Figura 8).

Microscopes designed primarily for observation in polarized light or differential interference contrast often have a Bertrand lens that is incorporated into the eyepiece observation tube unit or an intermediate tube that is inserted between the eyepiece tube and the microscope body. The Bertrand lens is somewhat more sophisticated than a simple phase telescope, and acts as a relay lens, transferring an image of the objective focal plane to the microscope intermediate image plane located in the eyepiece aperture diaphragm. Thus, with a Bertrand lens inserted into the microscope optical pathway, the objective rear focal plane (and phase plate/condenser annulus alignment) can be observed through the microscope eyepieces. On most microscopes equipped with a Bertrand lens, the lens can be rotated into and out of the optical pathway by means of a small thumbwheel mechanism located beneath the eyepiece tubes. Later model microscopes often mount the Bertrand lens in a turret along with lenses that change the image magnification factor. Adjustment is made with a small knob that is labeled B o Ph for the Bertrand lens position, and 0 or some other number for the magnification lens.

Both the phase telescope and Bertrand lens must be equipped with a mechanism for adjustment of focus, because the location of the objective rear focal plane can vary with magnification (as well as a number of additional factors), and lie at different levels within the microscope. Focusing a typical phase telescope is accomplished simply by twisting the eye tube (see Figura 7) until the objective rear focal plane is sharply focused. In a similar manner, a majority of the Bertrand lenses in modern microscopes are equipped with a focusing thumbwheel that enables the operator to focus the Bertrand-lens-eyepiece combination on the phase plate in the objective. When utilizing a matched set of objectives (parfocal, with the same optical correction and tube length), the rear focal plane position should remain essentially the same as magnification is changed, thus reducing the necessity to refocus the phase telescope or Bertrand lens.

Phase Contrast Microscope Alignment

Before attempting to align a microscope for phase contrast observation, examine the instrument carefully to ensure that all objectives contain phase plates and are firmly seated in the nosepiece. The objectives should also be sequentially ordered in their arrangement on the nosepiece, from lower to higher magnification, in order to minimize changeover frequency between one condenser annulus and another. Often the 10x and 20x objectives share a common condenser annulus, as do the 40x and 60x objectives. Highly corrected objectives, such as apochromats designed for oil immersion, often have similar numerical apertures and utilize the same condenser annulus over a wider range of magnification (40x to 100x). Low power phase contrast (4x and 5x) usually requires a swing-lens condenser and a specialized condenser annulus.

The condenser annular plates should also be sequentially arranged, starting with the annulus designed for the lower magnification objectives and proceeding up to the one designed for the highest magnification. In general, the entire magnification range can be covered with three or four individual annuli. If a universal condenser is employed, position the lowest magnification annulus (for example, PhL o Ph1) to the right of the brightfield slot, and the other plates in sequential order in the neighboring slots. Often, the specimen must be examined in brightfield either before or after phase contrast observation, so this arrangement will provide an easy work flow.

Presentado en Figura 8 are images of the objective rear focal plane in misalignment (Figure 8(a) and 8(c)) and after the condenser annulus and phase ring have been properly aligned (Figure 8(e)). Also illustrated in this figure are the corresponding images that appear when viewed through the eyepieces (Figure 8(b), 8(d), and 8(f)), which demonstrate how the specimen appears when the microscope is misaligned (Figure 8 (b) and 8(d)) and carefully aligned (Figure 8(f)) according to the procedure outlined below.

The following steps are recommended for the alignment of a phase contrast microscope.

  • Place a brightly stained specimen on the stage and rotate the 10x phase contrast objective into the optical pathway in brightfield illumination mode. Focus the specimen, and close the field diaphragm until it enters the edges of the viewfield. Using the condenser height adjustment knob, position the substage condenser so the individual leaves of the field diaphragm are in sharp focus, and use the main condenser centering adjustment knobs to ensure the field diaphragm is centered in the field of view. Carefully review the microscope configuration to ensure that Köhler illumination has been achieved, and the specimen is in sharp focus.
  • Remove the stained specimen and place a phase specimen on the microscope stage. In cases where the target specimen has only minimal optical path differences (and may be difficult to visualize), align the microscope with a specimen known to produce high contrast in phase contrast mode. Rotate the condenser turret until the appropriate annulus is positioned in the optical pathway (Ph1 or the equivalent for the 10x objective). Check to ensure that the condenser annulus color code or inscription matches that of the objective. Examine the position of the condenser aperture diaphragm lever and move it to the widest iris position (condensers designed for phase contrast may do this automatically).
  • If the microscope is equipped with a Bertrand lens, use the thumbwheel control to swing the lens into place. Alternatively, remove one of the microscope eyepieces and insert a phase telescope into the observation tube.
  • While peering through the eyepieces or phase telescope, adjust the focus of the Bertrand lens or telescope focus eye tube until the phase plate in the objective is in sharp focus, and the overlap between the bright image of the condenser annulus and dark neutral density material in the phase plate is apparent. In many cases, the microscope will initially be out of alignment and the annulus image will not accurately overlay the neutral density material in the phase plate (as illustrated in Figura 1 (a) y Figure 1(c)).
  • Locate the condenser annulus centering pins (or screws) and adjust the position of the annulus with a pair of screwdrivers or the appropriate knobs until it is coincident with the objective phase plate (Figure 1(e)). Note: do not attempt to adjust the position of the condenser annulus with the main condenser centering knobs (usually located on the condenser mounting bracket attached to the microscope). This effort will probably not achieve the intended condenser annulus alignment and will definitely compromise Köhler illumination conditions that should have been previously established.
  • When the condenser annulus is properly centered, the ring of light passing through the condenser will be attenuated by the neutral density material applied to the objective phase plate, reducing the intensity of the annulus image. Therefore, if the condenser annulus is improperly centered, a bright crescent edge will appear adjacent to the neutral density material in the objective phase plate (Figures 1(a) and 1(c)). If the image of the annulus does not fit within the dark circle of the phase plate, then either the condenser is out of focus (and Köhler illumination is not established), or the phase telescope (or Bertrand lens) is not focused on the objective rear focal plane. In some cases, even when the phase telescope (or Bertrand lens) and substage condenser are properly focused, the condenser annulus image is blurry and appears out of focus. This may be caused by low frequency diffraction from the specimen. If this occurs, remove the specimen from the stage and proceed with alignment of the microscope.
  • If the condenser annulus image is significantly different in size from that of the objective phase plate, check to see if the wrong annulus plate has been installed in the condenser (the most probable cause). Another possibility, if high numerical aperture oil immersion objectives are being employed, is that the condenser front lens element is designed to be immersed. In this case, it may be difficult (or impossible) to superimpose the condenser annulus on the phase plate without a drop of oil between the condenser lens and the microscope slide (and/or between the objective and the coverslip).
  • When the condenser annulus and objective phase plate are in proper alignment, the image illustrated in Figure 1(e) should appear in the phase telescope or eyepiece with a Bertrand lens in place. At this point, the microscope is properly configured for observation of the specimen with phase contrast illumination.
  • Replace the phase telescope with the eyepiece, or rotate the Bertrand lens out of the optical pathway, and examine the specimen. The background should appear a neutral gray in color (depending upon the neutral density of the objective phase plate) with the specimen visible in high contrast.

Once the microscope has been aligned for phase contrast, it will generally hold its centration for a considerable number of objective/annuli changes, but should be checked periodically to ensure proper alignment. If the microscope starts to slip out of alignment, the images appearing in the eyepieces (or on a computer monitor) will appear increasingly more like those observed with brightfield illumination.

Most of the microscope manufacturers provide a green interference or absorption filter with their auxiliary phase contrast kits, because the filter will produce monochromatic light having the same wavelength used for the original calibration of the objective phase plates. As a result, contrast is increased when the filter is inserted into the optical pathway (usually between the illumination condenser lens and the field diaphragm). A majority of the commercial phase plates are designed to produce phase shifts of a quarter wavelength in the green (550 nanometers) portion of the visible light spectrum. Theoretically, if white light is utilized instead of monochromatic light, extinction by interference will not be complete for all colors, and contrast will suffer. This limitation is particularly important if achromat objectives, which are corrected for chromatic aberration only in the green region, are utilized for phase contrast observation or image recording. However, with the current highly corrected fluorite and apochromatic objectives, the difference in contrast often is negligible, and therefore, insignificant.

The key to successful imaging with phase contrast illumination is to properly align the microscope, and to ensure that sufficiently thin specimens are spread evenly within the mounting medium on the microscope slide. Images made with exceedingly thick specimens often suffer from out-of-focus blur and contrast inversion artifacts that can be difficult to interpret. If the microscope is utilized for an extended period of time, occasionally check the objective rear focal plane to verify alignment of the condenser annulus with the phase plate in the objective.

Autores colaboradores

Douglas B. Murphy - Departamento de Biología Celular y Anatomía y Microscopio, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Ron Oldfield - Department of Biological Sciences, Division of Environmental and Life Sciences, Macquarie University, New South Wales 2109, Australia.

Stanley Schwartz - Bioscience Department, Nikon Instruments, Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville, New York 11747.

Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


UNICO Inverted Microscopes

Ergonomically designed, precisely manufactured and simple to use, this Inverted Microscope provides versatility and high quality images for brightfield and phase contrast observation.

Both binocular and trinocular optical configurations are available. Units come with paired extra-widefield 10X eyepieces. Left eyetube has diopter focus control. All models have a wide 50 to 75 mm interpupillary distance range. Microscopes come standard with LWD (Long Working Distance) objectives. Choose from plan achromat or plan achromat and plan phase contrast microscope configurations (see table below). Models with plan plan phase contrast objectives include a centering telescope. All units have standard built-in photographic and video ports (adapters also required) for advanced tissue culture, cell biology and microbiology procedures where cell behavior needs to be photographically documented. Order Reticule EF9041AP separately below for reticule and cross-hair.

The stand is all-metal with low position coaxial coarse and fine focusing. Fine focus resolution is 0.002 mm. The large, graduated (at 0.1 mm), oversized, mechanical stage is 242 x 172 mm. Center stage ring is 110 mm in diameter.

Microscopes feature a built-in 12V/30 W halogen illuminator with intensity adjustment and a handy lamp centering device. Also included is a centerable condenser with iris diaphragm and a phase annulus ring slot. The condenser can swing out to accommodate larger sample containers and the holder features an up-limit safety stop to help prevent accidental damage. Also included are filter discs with built-in blue, green, yellow and frosted filters.


Phase Contrast Microscope

Phase contrast microscopes constitute a vital component of modern biological research. The surfaces of glass plates within the body of phase microscopes are carefully scored to create rings. These rings induce a phase shift in the light passing through the medium being observed. Phase shifts create destructive interference patterns in the light that reaches the observer's eye. This method causes the observed image to appear out of normal phase by one half of one wavelength. Structures then become visible due to their contrast against a dark field behind them. Phase contrast microscopes allow researchers to observe differences between structures that have a similar level of transparency. By eliminating the need for time-consuming staining, phase microscopes allow research to be conducted more quickly and efficiently.

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Is my microscope compatible with Kohler illumination?

Köhler illumination requires several optical components to function. Most regular compound microscopes with the Abbe condenser and Iris diaphragm should be able to do so.

These components lie in order between the light source and the specimen to control the illumination of the specimen:

1. Collector lens and/or field lens – collect light from the light source and focus it on the plane of the condenser diaphragm.

2. Field diaphragm – control the size of light beam from collector lens.

3. Condenser diaphragm – control the size of the light beam into the condenser lens.

4. Condenser lens – project the light beam, without focusing it, through the s specimen.

[En esta figura] Schematics of Köhler illumination.
Photo source: https://en.wikipedia.org/wiki/K%C3%B6hler_illumination

This technique is recommended by all manufacturers of modern microscopes because it works very well. Let’s learn how to calibrate “Kohler illumination” to realize your microscope’s full potential.


Agradecimientos

This work was performed in part at the Melbourne Centre for Nanofabrication (MCN) in the Victorian Node of the Australian National Fabrication Facility (ANFF). We acknowledge funding through the Australian Research Council Discovery Projects Scheme (DP160100983, DP180101387) and the Center of Excellence Scheme (CE200100010). Furthermore, we acknowledge funding through the National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship (APP1124762) as well as the Albert Shimmins Continuity research fund.


Ver el vídeo: PARTES DEL MICROSCOPIO (Enero 2022).